降解玉米赤霉烯酮菌株的鑒定及其發(fā)酵條件優(yōu)化

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(湖北工業(yè)大學發(fā)酵工程教育部重點實驗室,工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北武漢 430068)

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是一種真菌毒素，也是世界上污染最廣泛的毒素[1],具有雌激素效應(yīng),是早期Stob等[2]從霉變的玉米中得到,其分子式為C18H22O5,化學名為6-(10-羥基-6-氧基-十一碳烯基)β-雷鎖酸內(nèi)酯,又稱為F-2毒素[3]。ZEN對小米、玉米、燕麥等都有污染作用[4],對人和動物也存在著危害,尤其對豬更為敏感,可致使流產(chǎn)、死胎,子宮內(nèi)膜纖維化以及生殖道體積增大[5-6],研究中也發(fā)現(xiàn)玉米赤霉烯酮能引起食道癌[7]。

降解ZEN方法有很多,在目前的方法中,物理法包括熱處理、剔除、脫殼、吸附劑吸附等[8-10],化學法包括臭氧處理、雙氧水處理等[11-12],但由于物理法和化學法成本較高,會破壞食品的營養(yǎng)價值，且在消除ZEN的過程中會帶入一些不確定的物質(zhì),所以近幾年使用生物法降解ZEN的越來越多。生物法降解玉米赤霉烯酮是指將一些真菌、細菌、霉菌如龜裂鏈霉菌(Streptomycesrimosus)[13]、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens,ZDS-1)[14]、黑曲霉(FS10)[15]等微生物作用于ZEN,并將ZEN轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)的方法。如Keller等[16]發(fā)現(xiàn)了釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)可將ZEN轉(zhuǎn)化為α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL,53%)和β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL烯醇,8%)這兩種衍生物,其中α-ZOL的雌激素毒性要遠遠低于ZEN。這種降解方法高效、無污染、無危害,不會降低食物的營養(yǎng)價值,特異性強,而微生物酶降解在市場上的需求量很大[17-19],因此生物法降解ZEN已成為現(xiàn)階段研究的熱點。

本文主要是對能降解玉米赤霉烯酮的菌株進行鑒定，并對其發(fā)酵上清液的發(fā)酵條件進行了單因素實驗,得到ZEN降解的較優(yōu)條件,為進一步探討ZENL09降解ZEN的機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌ZENL09 4 ℃保藏,本實驗室從土壤樣品中篩選得到;ZEN標準品4 ℃保存,以色列Fermentek公司;甲醇、乙腈 色譜純,美國Fisher Scientific公司;二氯甲烷 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;斜面培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨20,酵母粉10,葡萄糖20,瓊脂20;種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨20,酵母粉10,葡萄糖20;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨20,酵母粉10,葡萄糖20。

LC-20AD型高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司;WH-2型漩渦震蕩儀 上海滬西分析儀器有限公司;PHS-25型pH計 上海雷磁公司;TGL-16C型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠制造;3K15型臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司;ZHWY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠分析儀器制造有限公司;D2F-6090型真空干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的鑒定 將篩選得到的菌株(ZENL09)送往中國典型保藏物中心(CCTCC)進行鑒定,主要鑒定內(nèi)容為:微生物菌株16S rRNA基因序列的測定與分析;微生物菌株的形態(tài)觀察;微生物菌株的生理生化特性;微生物菌株的分類地位。

1.2.2 生長曲線的測定 將保藏的菌株在超凈臺中轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上,在30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后再轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中作為種子液,在160 r/min、30 ℃下培養(yǎng)，每隔2 h取一次樣,用滅菌的生理鹽水作為對照,在600 nm的波長下測定其吸光度(OD)值,當樣液濃度過高時采取適當?shù)南♂屘幚怼Ｒ設(shè)D值為縱坐標,培養(yǎng)時間為橫坐標做菌株的生長曲線。

1.2.3 發(fā)酵時間對ZEN降解率的影響 在溫度為30 ℃,轉(zhuǎn)速160 r/min,裝液量50 mL/250 mL,將種子液以5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,將發(fā)酵液分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h時,探究發(fā)酵時間對ZEN降解率的影響。

1.2.4 接種量對ZEN降解率的影響 在溫度為30 ℃,轉(zhuǎn)速160 r/min,裝液量50 mL/250 mL,種子液接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%、11%時,培養(yǎng)24 h,探究接種量對ZEN降解率的影響。

1.2.5 搖床轉(zhuǎn)速對ZEN降解率的影響 在溫度為30 ℃,搖床轉(zhuǎn)速分別為140、160、180、200、220 r/min時,裝液量50 mL/250 mL,將種子液以3%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h,探究搖床轉(zhuǎn)速對ZEN降解率的影響。

1.2.6 裝液量對ZEN降解率的影響 在溫度為30 ℃,搖床轉(zhuǎn)速200 r/min,裝液量分別為25、50、75、100、125、150 mL/250 mL,將種子液以3%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,探究裝液量對ZEN降解率的影響。

1.2.7 發(fā)酵溫度對ZEN降解率的影響 當溫度為27、30、33、36、39 ℃時,搖床轉(zhuǎn)速200 r/min,裝液量25 mL/250 mL,將種子液以3%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,探究發(fā)酵溫度對ZEN降解率的影響。

1.2.8 ZEN降解率的測定 取上述發(fā)酵液50 mL,8000 r/min離心10 min,然后將上清液倒入干凈的離心管中,調(diào)節(jié)上清液pH至7.5以下。取上清液950 μL倒入5 mL離心管中設(shè)置三組平行,向離心管中加入50 μL濃度為20 μg/mL的ZEN甲醇溶液,恒溫37 ℃反應(yīng)24 h。反應(yīng)后三組平行分別加入1 mL的二氯甲烷進行萃取(反復萃取三次),若萃取過程中發(fā)現(xiàn)液體渾濁，則再加入1 mL的甲醇溶液進行震蕩后完成萃取,將萃取后的液體真空干燥蒸發(fā)二氯甲烷。蒸發(fā)后用甲醇溶解殘存的ZEN,溶解液用0.22 μm的有機系濾膜過濾。以滅菌的液體培養(yǎng)基添加50 μL的ZEN作為空白對照組,將ZEN標準品用甲醇稀釋到濃度為1μg/mL作為對照組,參照國標GB/T5009.209-2016用高效液相色譜法測定玉米赤霉烯酮的降解率。ZEN降解率計算公式為:

高效液相色譜條件為:色譜柱:C18柱(250 mm×4.6 mm,4 μm);流動相:乙腈/水/甲醇=46/46/8(v/v/v);流速1.0 mL/min;柱溫:室溫;進樣量:20 μL;波長:236 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗做三組平行,采用SPSS Statistics WinWrap Basic Script軟件分析數(shù)據(jù)的顯著性,用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

圖1所示,ZENL09形態(tài)特征為:菌落表面粗糙不透明,微黃色帶點紅。橢圓到柱狀,著色均勻,無莢膜,周生鞭毛,為革蘭氏陽性菌。中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)測定該菌株的16S rRNA基因序列后，經(jīng)BLAST驗證發(fā)現(xiàn)，ZENL09與枯草芽孢桿菌的序列相似度很高達到99.51%。根據(jù)序列的比對結(jié)果構(gòu)建進化樹如圖2所示,ZENL09與Bacillussubtilis在同一分支上其同源性很高。

圖1 ZENL09形態(tài)學特征Fig.1 Morphological characteristics of ZENL09注:a.菌株ZENL09的平板菌落形態(tài); 菌株ZENL09顯微鏡觀察照片(1000×)。

圖2 基于16S rRNA序列的ZENL09菌株系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of ZENL09 strain based on 16S rRNA sequence

由菌株ZENL09的生理生化特性分析可知,在酶活與碳源同化試驗中,ZENL09可分解利用多種物質(zhì),也可在代謝過程中產(chǎn)生多種酶(見表1),在表2中可看出ZENL09可利用多種碳源產(chǎn)酸,這與枯草芽孢桿菌的的生理生化特性一樣,因此結(jié)合各項檢測結(jié)果最終鑒定ZENL09菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

表1 菌株ZENL09生理生化特性(酶活、碳源同化)Table 1 Physiological and biochemical characteristics of ZENL09(Enzyme activity,carbon source assimilation)

表2 菌株ZENL09生理生化特性-利用碳源產(chǎn)酸Table 2 Physiological and Biochemical Characteristics of ZENL09-acid production from carbon source

2.2 生長曲線的測定

由圖3可以看出,ZENL09在0～6 h生長很緩慢,在6 h后進入對數(shù)期,菌體濃度逐漸增大,菌生長較快,種子培養(yǎng)基變得濃稠,在此階段菌株生長的最好;24 h時菌體增長速率最高,此后24～30 h生長逐漸穩(wěn)定,細菌的繁殖速度逐漸下降,有部分細菌開始死亡。所以選擇24 h作為菌株ZENL09的生長時間即為種子液的培養(yǎng)時間。

圖3 ZENL09在種子培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.3 Growth curve of ZENL09 in seed medium

2.3 發(fā)酵時間對ZEN降解率的影響

由圖4分析可知,在24 h時ZEN的降解率達到最高,而后隨著發(fā)酵時間變長,ZEN的降解率反而降低。因此說明隨著發(fā)酵時間的增長,菌體大量繁殖,降解ZEN的活性物質(zhì)起初在增加，在48 h后,菌體繁殖越來越慢,死亡的菌數(shù)增多,導致作用于ZEN的活性物質(zhì)逐漸減少,因此后期ZEN的降解率降低。由此可見,發(fā)酵時間對ZEN的降解率有一定影響,所以選擇降解率最高的24 h作為發(fā)酵時間。

圖4 發(fā)酵時間對ZEN降解率的影響Fig.4 Effect of fermentation time on ZEN degradation rate注:不同小寫字母代表差異顯著(p<0.05);圖5～圖8同。

2.4 接種量對ZEN降解率的影響

如圖5所示,在接種量很少時,菌生長速度較慢,ZEN的降解率較低,隨著接種量的增多,ZEN的降解率先增高后逐漸降低,在接種量為3%時，ZEN降解率達到最高為72.5%,但與接種量為5%時無顯著性差異,當接種量高于5%時,ZEN的降解率逐漸降低,推測菌、體生長得速度比較快,可能快速過度到衰亡期[20],而使得只有部分存活的菌作用ZEN,從而導致ZEN降解率降低,因此選擇3%為最適接種量。

圖5 接種量對ZEN降解率的影響Fig.5 Effect of inoculum size on ZEN degradation rate

2.5 搖床轉(zhuǎn)速對ZEN降解率的影響

由于枯草芽孢桿菌是一種好氧菌,適宜在氧量高的環(huán)境下生長[21]。如圖6所示,隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加,ZEN的降解率在逐漸增加,說明搖床轉(zhuǎn)速越高,ZENL09菌的新陳代謝越快,能夠快速轉(zhuǎn)化為活性物質(zhì)并作用于ZEN上，使得其降解率越高。但當轉(zhuǎn)速為200和220 r/min時,ZEN降解率無明顯差異,然而相比較而言,轉(zhuǎn)速高時對于搖床的損耗是比較嚴重的,所以選擇200 r/min作為搖床轉(zhuǎn)速。

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對ZEN降解率的影響Fig.6 Effect of shaker speed on ZEN degradation rate

2.6 裝液量對ZEN降解率的影響

如圖7所示,由于裝液量越少,通氣效果好,溶氧系數(shù)大,利于菌體生長,所以當裝液量為25 mL/250 mL時，ZEN降解率最高,但與50 mL/250 mL無顯著性差異,因此從工藝成本考慮，選擇25 mL/250 mL為最適裝液量。

圖7 裝液量對ZEN降解率的影響Fig.7 Effect of liquid loading on the degradation rate of ZEN

2.7 發(fā)酵溫度對ZEN降解率的影響

隨著發(fā)酵條件的優(yōu)化,ZEN的降解率也越來越高,如圖8所示,在改變溫度的過程中,當發(fā)酵溫度為33 ℃時,ZEN的降解率高達96%,因此在此溫度下降解ZEN的物質(zhì)活性達到最大,當溫度繼續(xù)增加,ZEN降解率降低,可能是由于此時降解ZEN的物質(zhì)活性降低,故選擇33 ℃為最適發(fā)酵溫度。

圖8 發(fā)酵溫度對ZEN降解率的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on ZEN degradation rate

3 結(jié)論

從土壤中篩選出一株具有高效降解ZEN的菌株(ZENL09),通過16S rRNA序列分析、NCBI上的BLAST比對以及菌株形態(tài)觀察、理化特性分析,中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)鑒定該菌株ZENL09為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。通過改變枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)時間，確定種子液的最適生長時間為24 h,研究得到其發(fā)酵條件為:在溫度為33 ℃,轉(zhuǎn)速200 r/min,裝液量25 mL/250 mL時,將種子液以3%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,ZEN的降解率達到了96%。在接下來的實驗中,將進一步縮短ZEN與發(fā)酵上清液的反應(yīng)時間,并探究ZENL09的發(fā)酵上清液降解ZEN的機制以及降解的可能產(chǎn)物。