去除脫氧雪腐鐮刀菌烯醇乳酸菌的篩選及其作用條件

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(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON),又名嘔吐毒素,化學(xué)名稱為3,7,15-三羥基-12,13-環(huán)氧單端孢霉-9-烯-8-酮,是一種單端孢霉烯族化合物[1]。嘔吐毒素是鐮刀菌屬的次級代謝產(chǎn)物[2],主要產(chǎn)生菌為禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌,廣泛存在于污染的小麥、大麥、燕麥、玉米等谷物和飼料中[3]。近年來研究顯示,國內(nèi)飼料原料霉菌毒素污染超標(biāo)率高達(dá)60%～70%[4-6]。嘔吐毒素污染的谷物,其活性及營養(yǎng)成分含量大幅度降低。當(dāng)飼料或者糧食中的DON含量超過1 mg/kg時,會對人和動物的健康產(chǎn)生危害,例如厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)、反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀,嚴(yán)重時損害造血系統(tǒng),造成死亡[7]。因此,如何有效防控和降解飼料和食品中的嘔吐毒素始終是畜牧業(yè)和食品工業(yè)亟待解決的科學(xué)難題。

目前國內(nèi)外去除真菌毒素主要有物理、化學(xué)和生物方法三大類。物理方法包括熱處理、研磨去殼、輻照法等。物理方法對DON的清除不夠徹底,容易造成二次污染,并且要在很高的溫度或者苛刻的條件下才能去除,成本過高,實際使用較為困難。它們主要對吸附黃曲霉毒素有效,而對DON及其他霉菌毒素?zé)o效或效果很有限。能有效地使霉菌毒素解毒或失活的化學(xué)物質(zhì)有:氨氣、亞硝酸鈉、過氧酸、堿、臭氧溶液等[8],對DON的去除徹底迅速。但用化學(xué)方法處理谷物、飼料等原材料,不僅破壞食物的營養(yǎng)成分,降低適口性,甚至?xí)肫渌泻ξ镔|(zhì)。生物脫毒是利用微生物在其生長過程的代謝產(chǎn)物或是微生物自身的特性進(jìn)行脫毒,包括微生物降解和微生物吸附。其過程溫和,不需要使用有害化學(xué)試劑,不會造成營養(yǎng)物質(zhì)大量流失[9]。因此,生物方法作為高效、安全、無污染和條件溫和的處理方法成為研究的熱點。目前國內(nèi)外對于嘔吐毒素的研究剛剛起步,研究主要集中在嘔吐毒素降解菌的篩選方面。

近年來,很多研究都表明乳酸菌可以去除真菌毒素包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、單端孢霉烯毒素、伏馬菌素和展青霉素等[10-13]。乳酸菌對霉菌毒素的去除機制可能是細(xì)胞壁的吸附或者產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物將霉菌毒素轉(zhuǎn)化成另一種物質(zhì)[14-15]。但目前研究最多的主要是乳酸菌對黃曲霉毒素的清除,國內(nèi)關(guān)于DON的脫毒研究甚少,相關(guān)報道也不多。本實驗從腌魚、泡菜、酸馬奶原材料中以及實驗室保藏的菌株中篩選出能夠清除DON的乳酸菌,為利用該菌株去除飼料中或發(fā)酵產(chǎn)品中的DON奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腌魚 來自貴州;泡菜 來自韓國;酸馬奶 來自內(nèi)蒙古;DON 98%,加拿大TripleBond公司;甲醇 色譜純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;植物乳桿菌L163、嗜酸乳桿菌、副干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、綠色魏斯氏菌、清酒乳桿菌等菌種 由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院酶工程實驗室提供;MRS培養(yǎng)基:牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、吐溫80 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

TOMY-SX700立式壓力蒸汽滅菌器 日本TOMY公司;SW-CJ-1D型超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;Agilent 1100 series高效液相分析系統(tǒng)(配有可變波長紫外檢測器和Instrument色譜工作站) 美國Agilent公司;Eppendorf centrifuge 5804R臺式離心機 德國Eppendorf公司;UV-2600紫外分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離 在超凈工作臺上取出10 g腌魚、泡菜、酸馬奶,剪碎,放入裝有玻璃珠的250 mL無菌三角瓶中,倒入90 mL 滅菌的生理鹽水,放置于37 ℃,180 r/min的搖床中震蕩30 min后,取出,吸取1 mL培養(yǎng)液于裝有9 mL生理鹽水的試管中,渦旋儀震蕩混勻,連續(xù)梯度稀釋,吸取100 μL的10-3～10-6稀釋度的菌懸液,均勻涂布于MRS平板上,37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h。待其長出菌落后,觀察菌落的顏色、大小、隆起度、邊緣形態(tài)、干濕狀態(tài)及透明程度等,挑取形態(tài)等表征有差別的單菌落進(jìn)行分離純化,劃線接種于MRS培養(yǎng)基,于4 ℃冰箱保藏,用于后續(xù)的篩選。

1.2.2 乳酸菌的活化 實驗室保藏菌株,從凍存的甘油管中取出,在MRS平板上劃線培養(yǎng),37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h后,挑取生長良好的單菌落接種到MRS液體培養(yǎng)基中靜置24 h,培養(yǎng)溫度37 ℃。然后按2%接種量將此活化后的實驗菌株培養(yǎng)液接種到MRS液體培養(yǎng)基中，于溫度為37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h,傳代2次。

1.2.3 去除DON乳酸菌的初步篩選 乳酸菌活化2次后,4000 r/min,4 ℃條件下離心10 min,收集菌體,用生理鹽水洗滌2次,以除去培養(yǎng)基等成分的干擾,最后重懸于生理鹽水中,調(diào)整菌體含量至1010CFU/mL以上。加入DON標(biāo)準(zhǔn)品,使得DON的終濃度為50 μg/mL,放置于37 ℃搖床中震蕩培養(yǎng)1 h,取出后再放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23 h。10000 r/min,4 ℃條件下離心10 min,取上清,過0.22 μm濾膜,HPLC檢測,計算DON去除率。

1.2.4 去除DON的乳酸菌的復(fù)篩 初篩所得去除率30%以上的菌株,菌種保藏管凍存,用于后續(xù)實驗。菌株在MRS液體培養(yǎng)基中活化2次后,離心收集菌體,生理鹽水洗滌2次后,重懸于生理鹽水中,調(diào)整菌體濃度為1010CFU/mL以上,加入終濃度為50 μg/mL的DON,共培養(yǎng)12、24、36、48 h,并分別取出1 mL,10000 r/min,4 ℃條件下離心10 min,取上清,過0.22 μm濾膜,HPLC檢測,計算DON去除率。

1.2.5 乳酸菌對DON耐受力的測定 副干酪乳桿菌活化2次后,以2%的接種量分別接種于含DON 0、20、50、100、200、500 μg/mL的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,每隔2 h取樣,利用分光光度計測量600 nm波長下的吸光度值。

1.2.6 菌體濃度對菌株去除DON的影響 乳酸菌活化后,4000 r/min,4 ℃條件下離心10 min,收集菌體,生理鹽水洗滌2次后,分別調(diào)整菌體濃度為5.0×108、1.0×109、5.0×109、1.0×1010CFU/mL以上,pH為7.0,加入DON,使其終濃度為50 μg/mL,分別放置于37 ℃培養(yǎng)24 h,取出1 mL,10000 r/min,4 ℃條件下離心10 min,取上清,過0.22 μm濾膜,HPLC檢測,計算DON去除率。

1.2.7 溫度對菌株去除DON的影響 按1.2.6方法,調(diào)整菌體濃度為1010CFU/mL以上,重懸于生理鹽水中,pH為7.0,加入終濃度為50 μg/mL的DON,分別放置于25、30、33、37、40 ℃培養(yǎng)24 h,其它操作同1.2.6,計算DON去除率。

1.2.8 pH對菌株去除DON的影響 按1.2.6方法,調(diào)整菌體濃度為1010CFU/mL以上,分別重懸于pH為4、5、6、7、8的生理鹽水中,加入DON,使其終濃度為50 μg/mL,37 ℃培養(yǎng)24 h,其它操作同1.2.6,計算DON去除率。

1.2.9 DON含量的檢測

1.2.9.1 DON標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用去離子水配置12.5、25、50、100、125、200 μg/mL的DON標(biāo)準(zhǔn)品溶液,HPLC檢測,建立峰面積與DON濃度之間的一元線性回歸方程。根據(jù)不同濃度DON的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性方程為y=33.516x+10.986,相關(guān)系數(shù)為0.9999,表明DON的濃度在12.5～200 μg/mL范圍內(nèi),與對應(yīng)的峰面積之間具有良好的線性關(guān)系。

1.2.9.2 色譜條件 色譜柱為:Aligent 5 HC-C18(2)250 mm×4.6 mm。流動相為甲醇∶水=30∶70,流速為0.6 mL/min,紫外檢測器,檢測波長218 nm,進(jìn)樣量20 μL,柱溫25 ℃。

1.2.9.3 去除率的計算 以不接菌含有DON的生理鹽水為空白對照組,接菌含有DON的生理鹽水為實驗組,在相同條件下培養(yǎng)相同時間。

式中A:空白組DON的含量,B:實驗組DON的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖,采用SPSS Statistics 22進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 去除DON的乳酸菌的初步篩選

利用共培養(yǎng)的方式,從150株乳酸菌中初步篩選出32株能夠清除DON的乳酸菌,結(jié)果如圖1所示。不同的菌株對DON的去除能力因菌株間差異而各不相同,去除率在15%～40%,選擇去除率在30%以上的乳酸菌Y-30、Y-35、Y-31、Y-33、D-8、副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌進(jìn)行復(fù)篩。

圖1 乳酸菌對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的去除率的影響Fig.1 Influence of lactic acid bacteria on the removal rate of deoxynivalenol注:菌株編號“Y”表示菌株來源于腌魚;“P”表示菌株來源于泡菜;“D”表示菌株來源于酸馬奶。已知名稱的菌株來源于本研究室所保藏菌株。(表1同)。

2.2 去除DON的乳酸菌的復(fù)篩

對2.1中得到的7株菌株進(jìn)行復(fù)篩,并分別測定12、24、36、48 h下DON的去除率,復(fù)篩的結(jié)果見表1。隨著時間的延長,DON的去除率會有所變化,且不同菌株變化不一致。大部分的菌株在24 h時去除率達(dá)到最大值,36 h后去除率有所降低,可能是部分被吸附的DON又重新釋放到了體系中。鼠李糖乳桿菌對DON的去除效果最好,這和Turner P C[16]等的研究結(jié)果一致。但鑒于目前關(guān)于該菌株的研究較多,且副干酪乳桿菌對DON的去除率也較高,在24 h時可以清除40.1%的DON,因此選擇副干酪乳桿菌進(jìn)行下一步研究。Franco等[17]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高溫滅活后的副干酪乳桿菌去除DON的能力比活菌提高了一倍多,并且副干酪乳桿菌的發(fā)酵上清液能有效抑制禾谷鐮刀菌IAPAR 2218的生長。鑒于副干酪乳桿菌對DON的高效去除能力,以及國內(nèi)關(guān)于副干酪乳桿菌去除DON的研究尚未報道,因此本文選擇副干酪乳桿菌做后續(xù)實驗研究。

表1 去除DON的乳酸菌的復(fù)篩Table 1 Rescreening of DON removal capability of lactobacillus

根據(jù)不含副干酪乳桿菌菌體的對照組的HPLC圖(圖2A)可知,DON的出峰時間時11.4 min左右。對比對照組和實驗組DON的峰面積(圖2B),發(fā)現(xiàn)實驗組的峰面積有明顯下降,由液相圖可以直觀地看出副干酪乳桿菌對DON有去除效果。

圖2 副干酪乳桿菌去除DON的HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograms of DON removal ability of Lactobacillus paracasei注：A：不加菌體的空白對照;B：加入菌體的共培養(yǎng)體系。

2.3 副干酪乳桿菌對DON的耐受力

由于嘔吐毒素對細(xì)胞有一定的毒害作用,因此乳酸菌對DON的高耐受能力是應(yīng)用于實際的前提條件。

結(jié)果表明(圖3),低濃度(0～20 μg/mL)的嘔吐毒素含量對乳酸菌的生長沒有太大的抑制作用,濃度為20 μg/mL的DON的生長情況與不加DON的空白組生長情況基本吻合。濃度分別為50、100 μg/mL的DON對乳酸菌的生長有輕微的抑制,并且在12 h以前,影響作用不大,在12 h后,生長變得有所緩慢。由此可見乳酸菌對中低濃度的DON有一定的耐受能力。對于高濃度的DON(200 μg/mL),菌體生長緩慢,抑制生長作用較明顯。龔雪[18]研究乳酸菌LB-11對展青霉素的耐受力時,發(fā)現(xiàn)在含有不同濃度展青霉素的培養(yǎng)基中,該乳酸菌的生長并沒有受到影響,生長曲線與空白組幾乎重合。這種對DON的高耐受力和去除能力，為利用該菌株去除禾谷原料或發(fā)酵產(chǎn)品中的DON奠定基礎(chǔ),有利于保證人畜的食品和飼料安全。

圖3 副干酪乳桿菌對DON耐受力Fig.3 DON tolerance capbility of lactobacillus paracasei

2.4 菌體濃度對副干酪乳桿菌去除DON效果的影響

菌體濃度的增加對DON的脫毒效果具有明顯的促進(jìn)作用(圖4)。隨著菌體濃度的升高,副干酪乳桿菌對DON的去除率逐漸增加,當(dāng)菌體濃度為1.0×1010CFU/mL,去除率高達(dá)40%左右。由此可以看出,乳酸菌菌體濃度對DON去除率的影響很大。這可能是由于菌體濃度增多,能夠吸附的DON含量越多。劉暢[19]、駱翼[20]研究益生菌對黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮的脫毒效果時發(fā)現(xiàn),隨著菌體量的增加,去除效果也越高,與本文研究結(jié)果一致。

圖4 不同菌體濃度下副干酪乳桿菌對DON去除率的影響Fig.4 Influence of bacterial concentration on DON-removing-capacity by lactobacillus paracasei注:不同字母代表組間差異顯著(p<0.05)；圖5～圖6同。

2.5 溫度對副干酪乳桿菌去除DON效果的影響

溫度通過影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)如細(xì)胞膜的流動性及完整性來影響微生物的生長、繁殖和新陳代謝。過高的環(huán)境溫度會導(dǎo)致蛋白質(zhì)或核酸的變性失活,而過低的溫度會使酶活力受到抑制,細(xì)胞的新陳代謝活動減弱。本研究中,在較低溫度25、30 ℃時,去除率在15%左右,而隨著溫度的升高,去除率增加,在37 ℃時,去除率達(dá)到最大值35.39%。因此,37 ℃為最適溫度。楊史良[21]研究發(fā)現(xiàn)益生菌清除DON的最適溫度為37 ℃,崔玉琦[22]篩選出一株對黃曲霉毒素有降解效果的芽孢桿菌時,發(fā)現(xiàn)在37 ℃的溫度下,去除能力最大,可能由于該菌是從腸道中篩選出來的,而動物腸道溫度一般為37 ℃左右。

圖5 不同溫度下副干酪乳桿菌對DON去除率的影響Fig.5 Influence of temperature on DON- removing-capacity by lactobacillus paracasei

2.6 pH對副干酪乳桿菌去除DON效果的影響

環(huán)境pH對微生物的生命活動有很大的影響,同時還影響了細(xì)胞表面的電荷分布。在研究過程中發(fā)現(xiàn),pH對DON去除率影響較大,在較低pH4、5時,去除率低,在20%左右,隨著pH的升高,去除率增加,在pH7時,去除率達(dá)到最大值40.4%(圖6)。最適pH也因菌株、毒素差異而各有不同。Zhao等[23]在研究乳桿菌清除黃曲霉毒素B1去除機理時,發(fā)現(xiàn)pH3時,去除率達(dá)到最高。龔雪[18]在研究乳酸菌LB-11去除展青霉毒素時,發(fā)現(xiàn)pH3～7時,去除能力都較高。

圖6 不同pH下副干酪乳桿菌對DON去除率的影響Fig.6 Influence of pH on DON- removing-capacity by lactobacillus paracasei

3 結(jié)論

本研究篩選出了一株能夠清除DON的副干酪乳桿菌,目前國內(nèi)尚未有相關(guān)報道。在DON終濃度為50 μg/mL的體系中,去除率在24 h達(dá)到40.1%。同時,對副干酪乳桿菌的脫毒條件進(jìn)行了研究,包括菌體濃度、pH、反應(yīng)溫度。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)菌體濃度達(dá)到1010CFU/mL以上時,在反應(yīng)溫度為37 ℃,pH為7的條件下,去除率達(dá)到最大值。利用乳酸菌能夠去除DON的特性,可以將其用于食品或者飼料的發(fā)酵,既可以提高食品的安全性,也可以提高食品的營養(yǎng)價值,改善食品風(fēng)味,同時節(jié)約成本,具有潛在的應(yīng)用前景。