miRNA-326調(diào)控胃癌細(xì)胞活力和凋亡的機(jī)制及其在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義*

袁 靜， 周 捷△， 劉海潮， 徐瑞娟， 劉玉榮， 章必成

(1武漢理工大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科， 2解放軍武漢總醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 3解放軍武漢總醫(yī)院腫瘤科， 湖北 武漢 430070)

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮細(xì)胞的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率一直位于世界惡性腫瘤的前列。近年來，全球范圍內(nèi)胃癌的發(fā)病率和死亡率均有下降，但在我國胃癌仍是僅次于肺癌的第2大腫瘤致死因素，是威脅人們身體健康和生活質(zhì)量的重要原因[1-2]。臨床上，胃癌的治療仍是以手術(shù)為主，放療、化療和藥物治療等多種手段相結(jié)合的綜合治療，然而治療效果并不樂觀，患者的5年生存率不足30%[3-4]。胃癌的發(fā)生與發(fā)展是一個多因素、多步驟的復(fù)雜過程，與多種基因的調(diào)控密切相關(guān)。微小RNA(microRNA， miRNA)是一類小分子RNA，在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中揮發(fā)著重要作用[5-6]。miRNA-326是miRNAs中的一員，在多種腫瘤如肝癌、結(jié)腸癌和膠質(zhì)瘤等組織中異常表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖凋亡過程[7-10]，但其在胃癌中的作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究通過收集組織標(biāo)本，觀察miRNA-326在胃癌組織中的表達(dá)并分析其臨床意義，并在體外探究其在胃癌細(xì)胞活力和凋亡中的作用及其機(jī)制，為胃癌診斷和治療提供一定的實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1標(biāo)本收集 自2015年7月～2017年3月收集本院確診并接受治療的55例胃癌患者的腫瘤組織和癌旁組織(距腫瘤邊緣至少5 cm)，其中，男性32例，女性23例，年齡45～71歲，中位年齡為58歲，其中，>56歲的有22例，≤56歲的有33例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性有26例，陽性有29例；腫瘤直徑>5 cm有19例，≤5 cm有36例；分化程度高分化有11例，中分化有19例，低分化有25例；參照AJCC第7版的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期有5例，Ⅱ期有22例,Ⅲ期有28例。所參選患者術(shù)前均知情同意，并且均未接受任何放化療。將收集到的標(biāo)本組織均放入液氮罐中，保存于-80 ℃的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2細(xì)胞、試劑和儀器 胃癌細(xì)胞BGC-823和正常胃黏膜細(xì)胞GES-1購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。10%胎牛血清購于Gibco；DMEM培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基購于Bio-Rad；抗基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)(1∶1 000稀釋)、p21(1∶800稀釋)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)(1∶800稀釋)、Bcl-2(1∶1 000稀釋)、cleaved caspase-3(1∶800稀釋)和β-actin(1∶1 000稀釋)抗體及HRP標(biāo)記的羊抗兔/鼠 II 抗(1∶2 000稀釋)均購于Abcam；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購于Hyclone；CCK-8試劑和BCA蛋白定量試劑盒購于博邁德生物；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購于上海碧云天公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于上海浩然生物技術(shù)有限公司，miRNA-326 mimic、mimic陰性對照(mimic negative control，mimic-NC)和PCR引物均購于蘇州吉瑪公司；pmiR-RB-ReportTM、pmiR-CCND1-WT和pmiR-CCND1-Mut質(zhì)粒購于Ribobio；Lipofectamine 2000、TRIzol試劑和PVDF膜均購于lnvitrogen。-80 ℃冰箱(海爾公司)；CO2培養(yǎng)箱(RS Biotech)；紫外分光光度計(Invitrogen)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)；電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；酶標(biāo)儀(Biotek)；流式細(xì)胞儀(Beckman)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 取凍存的BGC-823細(xì)胞和GES-1細(xì)胞，于37 ℃水浴鍋中解凍復(fù)蘇，轉(zhuǎn)入離心管后，加入RPMI-1640完全培養(yǎng)基混勻后，離心棄上清，再加入培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基，置于37 ℃、 5% CO2和濕度95%的培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，每2 d換液，待細(xì)胞融合度在80%左右時，加胰蛋白酶(濃度為0.05%)按1∶2比例傳代。收集第3代細(xì)胞進(jìn)行實驗。

2.2RT-qPCR檢測胃癌組織和細(xì)胞中miRNA-326的表達(dá) 取粉碎的組織標(biāo)本和收集到的BGC-823細(xì)胞、GES-1細(xì)胞，分別加入TRIzol 試劑提取總RNA，并采用紫外分光光度計檢測總RNA的濃度，再根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成模板cDNA，以U6為內(nèi)參照，檢測胃癌組織和癌旁組織中miRNA-326的表達(dá)情況，每組樣本設(shè)3個平行孔。miR-326的上游引物為5’-ACTGTCCTTCCCTCTGGGC-3’，下游引物為5’-AATGGTTGTTCTCCACTCTCTCTC-3’；U6的上游引物為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。PCR的擴(kuò)增條件為預(yù)變性 94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 15 s、退火62 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 30 s，循環(huán)35次，總延伸72 ℃ 5 min。采用2-ΔΔCt法檢測miRNA-326的相對表達(dá)量。

2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集對數(shù)生長期的BGC-823細(xì)胞，計數(shù)，以每孔100 μL 含4.5×106細(xì)胞的懸液進(jìn)行種植，培養(yǎng)過夜。次日，進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分為：正常對照組(未做轉(zhuǎn)染)、mimic-NC組(轉(zhuǎn)染mimic-NC)和miRNA-326 mimic組(轉(zhuǎn)染miRNA-326 mi-mic)。先配制轉(zhuǎn)染液：采用RPMI-1640培養(yǎng)基(無胎牛血清)將miRNA-326 mimic、 mimic-NC(終濃度為 200 μmol/L)和轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行稀釋，充分孵育后，將Lipofectamine 2000分別與miRNA-326 mimic和mi-mic-NC混合反應(yīng)30 min。根據(jù)分組，將Lipofectamine 2000+miRNA-326 mimic混合液加入miRNA-326 mimic組中，Lipofectamine 2000+mimic-NC混合液加入mimic-NC組中，于孵箱中孵育5 h后，更換含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集各組細(xì)胞進(jìn)行檢測，參照2.2中的方法檢測miRNA-326的轉(zhuǎn)染情況。

2.4CCK-8法檢測細(xì)胞的活力 取生長對數(shù)期的BGC-823細(xì)胞，制成濃度為5×107/L的細(xì)胞懸液，以每孔100 μL在96孔板上進(jìn)行接種，實驗分組及處理同2.3，并且每組實驗設(shè)置5個平行復(fù)孔，每組重復(fù)3次，于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。分別在轉(zhuǎn)染后24、48和72 h后收集細(xì)胞，每孔加入CCK-8溶液10 μL，充分混勻后，孵育2 h，以酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，檢測波長為490 nm。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取轉(zhuǎn)染后48 h的各組BGC-823細(xì)胞，每組細(xì)胞設(shè)置3個平行實驗。先離心去上清，再以磷酸緩沖液漂洗2次，離心后，參照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，檢測各組細(xì)胞的凋亡率。

2.6Western blot檢測增殖和凋亡相關(guān)蛋白的水平 收集轉(zhuǎn)染后48 h的各組BGC-823細(xì)胞于離心管中，加入裂解液RIPA提取總蛋白，并參照BCA試劑盒說明書檢測得到總蛋白的濃度。將5×上樣緩沖液與蛋白樣品混合液放入100 ℃水浴中5 min變性。取50 μg變性蛋白上樣至SDS-PAGE凝膠孔中，電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)PVDF膜、封閉液封閉后，加入 I 抗過夜(4 ℃下)，次日洗膜后，加入 II 抗，37 ℃下孵育2 h。滴加ECL發(fā)光顯影液，以凝膠成像儀顯影， Quantity One軟件進(jìn)行條帶分析，以β-actin為內(nèi)參照，目的條帶與內(nèi)參照的灰度比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

2.7miRNA-326 靶基因的預(yù)測 采用RT-qPCR和Western blot檢測正常對照組、mimic-NC組和miRNA-326 mimic細(xì)胞中cyclin D1的mRNA和蛋白表達(dá)情況，具體步驟參照2.2和2.6，其中，cyclin D1上游引物序列為5’-CCCACTCCTACGATACGC-3’，下游引物序列為5’-AGCCTCCCAAACACCC-3’；內(nèi)參照β-actin的上游引物序列為5’-GGCGGCAACACCATGTACCCT-3’,下游引物序列為5’-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3’。構(gòu)建野生型pmiR-CCND1-WT和突變型pmiR-CCND1-Mut的CCND1 3’-UTR螢光素酶報告載體。按照野生型+miRNA-326 mi-mic、突變型+miRNA-326 mimic和mimic-NC+mi-RNA-326 mimic進(jìn)行分組和轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞，于孵箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，按照雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒使用步驟檢測各組細(xì)胞的螢光素酶活性。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗中數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，運用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行2檢驗、單因素方差分析(one-way ANOVA)和t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miRNA-326在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義

與癌旁組織相比，miRNA-326在55例胃癌組織中的平均相對表達(dá)量明顯下降(P<0.05)，見圖1。表1顯示miRNA-326的表達(dá)水平與年齡和性別無關(guān)，但與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及臨床分期均有顯著相關(guān)性(P<0.05)。從胃癌組織中miRNA-326的表達(dá)水平分析：腫瘤直徑>5 cm 的低于腫瘤直徑≤5 cm的(P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的(P<0.05)，分化程度高的低于分化程度低的(P<0.05)，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期的低于Ⅰ～Ⅱ期的(P<0.05)。進(jìn)一步回顧分析和跟蹤隨訪，發(fā)現(xiàn)miRNA-326表達(dá)水平與患者的總生存期存在相關(guān)性，miRNA-326低表達(dá)的患者生存率明顯低于miRNA-326高表達(dá)患者(P<0.05)，見圖2。

Figure 1. The expression of miRNA-326 in the gastric cancer and paracancerous tissues. Mean±SD. n=55. *P<0.05.

表1 miRNA-326的表達(dá)與55例胃癌患者臨床特征的關(guān)系

Figure 2.The correlation between miRNA-326 expression and total survival of gastric cancer patients. Mean±SD. *P<0.05 vs high expression of miRNA-326.

2 轉(zhuǎn)染miRNA-326 mimic 后胃癌BGC-823細(xì)胞中miRNA-326表達(dá)水平升高

以BGC-823細(xì)胞為例，先確認(rèn)miRNA-326在胃癌BGC-823細(xì)胞的低表達(dá)后，轉(zhuǎn)染miRNA-326 mimic，以構(gòu)建miRNA-326高表達(dá)的胃癌細(xì)胞株，RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，胃癌BGC-823細(xì)胞中miRNA-326的相對表達(dá)水平明顯低于正常胃黏膜GES-1細(xì)胞(P<0.05)；同時，正常對照組與mimic-NC組相比miRNA-326表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，但miRNA-326 mimic組的miRNA-326的表達(dá)水平與正常對照組和mimic-NC組相比顯著升高(P<0.05)，見圖3。

3 上調(diào)miRNA-326表達(dá)抑制BGC-823細(xì)胞的活力

CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miRNA-326 mimic后，BGC-823細(xì)胞在24、48和72 h的吸光度(A)值均明顯低于正常對照組(P<0.05)，而mimic-NC組與正常對照組間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見表2。Wes-tern blot進(jìn)一步檢測各組細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白MMP-9和p21的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常對照組比較，miRNA-326 mimic組中MMP-9的表達(dá)水平明顯降低，p21表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；mimic-NC組中2種蛋白的表達(dá)水平與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖4。

4 上調(diào)miRNA-326表達(dá)促進(jìn)BGC-823細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測正常對照組、mimic-NC組和miRNA-326 mimic組細(xì)胞周期變化、凋亡率和相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。與正常對照組相比，miRNA-326 mimic組細(xì)胞在G1期的百分比和凋亡率均明顯升高，而細(xì)胞在G2期的百分比及Bcl-2蛋白水平均降低，cleaved caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)；而mimic-NC組細(xì)胞周期、凋亡率、Bcl-2蛋白表達(dá)水平和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖5、6。

Figure 3.The expression of miRNA-326 in normal gastric mucosa GES-1 cells and gastric cancer BGC-823 cells (A) and the expression of miRNA-326 in BGC-823 cells of each group after transfection (B). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs GES-1 cells; △P<0.05 vs normal control group; #P<0.05 vs mimic-NC group.

表2 各組BGC-823細(xì)胞不同時點A值的變化

*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vsmimic-NC group.

Figure 4.The protein expression of MMP-9 and p21 in the BGC-823 cells in each group. Mean±SD. n=3. * P<0.05 vs normal control group; # P<0.05 vs mimic-NC group.

5 CCND1是miRNA-326的靶基因

RT-qPCR和Westerm blot檢測結(jié)果示，與正常對照組和mimic-NC組相比，miRNA-326 mimic組細(xì)胞中cyclin D1的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見圖7A、B;雙螢光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，與mimic-NC+miRNA-326 mimic組相比，轉(zhuǎn)染pmiR-CCND1-WT質(zhì)粒細(xì)胞的螢光素酶活性降低(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染pmiR-CCND1-Mut質(zhì)粒的螢光素酶活性無顯著改變，見圖7C。

討 論

miRNA-326在多種疾病中異常表達(dá)，可通過多種途徑參與細(xì)胞的增殖和凋亡過程，影響疾病的進(jìn)程。miRNA-326在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的外周血單個核細(xì)胞和血漿中異常高表達(dá)，與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎活動度關(guān)系密切[11]；而其在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平顯著低于正常腦組織，與晚期病理分級和KPS評分等有關(guān)。目前，miRNA-326在胃癌中的研究較少，其作用機(jī)制并不清晰。為了探討miRNA-326在胃癌中的作用機(jī)制，本研究先通過觀察55例胃癌組織中miRNA-326中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-326在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織。該結(jié)果與張小靜等[12]發(fā)現(xiàn)miRNA-326在高轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)的結(jié)果相一致。進(jìn)一步觀察miRNA-326與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與腫瘤直徑>5 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高分化程度以及Ⅲ～Ⅳ期臨床分期均有顯著相關(guān)性，而與患者的年齡和性別無關(guān)；同時還發(fā)現(xiàn)，miRNA-326低表達(dá)的患者生存率明顯小于miRNA-326高表達(dá)患者，提示miRNA-326可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。

Figure 5.The changes of cell cycle distribution in each group were analyzed by flow cytometry. Mean±SD. n=3. * P<0.05 vs normal control group; # P<0.05 vs mimic-NC group.

Figure 6.Apoptosis of BGC-823 cells and the protein levels of apoptosis-related proteins Bcl-2 and cleaved caspase-3 in each group. A: the results of flow cytometry analysis; B: the results of Western blot for determining the relative protein levels. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs normal control group; # P<0.05 vs mimic-NC group.

細(xì)胞的惡性增殖是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一，受細(xì)胞周期相關(guān)基因的調(diào)控，cyclin D1是細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的重要正向調(diào)控基因，可調(diào)控G1/S進(jìn)程；p21是細(xì)胞周期蛋白依賴激酶的直接抑制因子，抑制cyclin D1-CDK4復(fù)合物的活性，使細(xì)胞周期停滯在G1期；兩者的異常表達(dá)均與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13-14]。大量研究顯示，miRNA-326在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[15-16]。本研究在成功上調(diào)胃癌BGC-823細(xì)胞中miRNA-326的表達(dá)后，采用CCK-8法檢測細(xì)胞的活力，并進(jìn)一步檢測細(xì)胞中p21和cyclin D1的表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miRNA-326 mimic的細(xì)胞活力下降，細(xì)胞中cyclin D1表達(dá)水平下降，而p21表達(dá)升高。這一結(jié)果可能與Zhou等[17]所報道的通過上調(diào)miRNA-326誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞G1期阻滯的內(nèi)在機(jī)制有關(guān)。同時，腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移也在腫瘤的生長中發(fā)揮著重要作用。MMP-9是一種與腫瘤細(xì)胞分化、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶，可通過降解基底膜，影響新血管的生成和血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，進(jìn)而影響腫瘤的生長。MMP-9與胃癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均有關(guān)[18]。本研究進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miRNA-326 mimic的細(xì)胞中MMP-9表達(dá)水平明顯降低，提示在胃癌中，低表達(dá)miRNA-326可能通過上調(diào)MMP-9表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長。

Figure 7.The expression of cyclin D1 at mRNA and protein levels in the BGC-823 cells of each group and the identification of miRNA-326 target gene by determining the luciferase activity. A: the relative mRNA expression of cyclin D1; B: the Western blot detection of cyclin D1 protein expression; C: the luciferase activity. Mean±SD. n=3. * P<0.05 vs normal control group; # P<0.05 vs mimic-NC group; &P<0.05 vs mimics-NC+miRNA-326 mimic group; △P<0.05 vs Mut+miRNA-326 mimic group.

腫瘤細(xì)胞的惡性增殖又往往是細(xì)胞凋亡受抑的結(jié)果。Bcl-2是公認(rèn)的抗凋亡蛋白，caspase-3是重要的凋亡執(zhí)行蛋白，兩者均在胃癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[19-20]。本研究通過流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染miRNA-326 mimic后，BGC-823細(xì)胞的凋亡情況，并檢測Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)以評估細(xì)胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-326 mimic組細(xì)胞的凋亡率較正常對照組明顯升高，并且Bcl-2蛋白表達(dá)下降，而cleaved caspase-3表達(dá)升高。提示，在胃癌的發(fā)生發(fā)展中，低表達(dá)miRNA-326可能通過上調(diào)Bcl-2和下調(diào)cleaved caspase-3 表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞凋亡。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，Sun等[21]在非小細(xì)胞肺癌中指出CCND1是miRNA-326的靶基因。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，miRNA-326從蛋白水平和mRNA水平均對cyclin D1有明顯的調(diào)控作用。為了探討在胃癌中，CCND1是否也是miRNA-326的靶基因，本研究采用雙螢光素酶報告基因檢測的方法進(jìn)行確認(rèn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染pmiR-CCND1-WT質(zhì)粒的細(xì)胞中螢光素酶活性降低，而轉(zhuǎn)染pmiR-CCND1-Mut質(zhì)粒的螢光素酶活性無顯著改變。因此，認(rèn)為miRNA-326在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，可能通過靶向CCND1而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長。

綜上所述，miRNA-326在胃癌中低表達(dá)，可能通過靶向調(diào)控CCND1而促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡。該實驗結(jié)果進(jìn)一步豐富了miRNA-326在胃癌發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制，為胃癌以miRNA-326為靶點的診斷和治療提供了新的參考依據(jù)。