槲皮苷通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡*

陳龍?jiān)疲?柳 葉

(湖北中醫(yī)藥大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 2檢驗(yàn)學(xué)院， 湖北 武漢 430065)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，病因復(fù)雜，在我國各種惡性腫瘤發(fā)病率中居第2位，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球胃癌術(shù)后5年總生存率僅為10%～15%[1]。藥物化療是治療腫瘤的3大手段之一，但大部分化療藥物毒副作用較強(qiáng)，對機(jī)體正常細(xì)胞傷害較大。天然抗癌化合物在過去幾十年中對癌癥的治療做出了巨大貢獻(xiàn)，因此對于天然抗癌化合物的發(fā)掘以及研究則十分重要。槲皮苷(quercitrin)即槲皮素-3-O-鼠李糖苷，是一種黃酮類單體化合物，廣泛存在于植物中。有研究表明，槲皮苷具有降血脂、降血糖、抗氧化和抗病毒等作用[2]。近年來，越來越多的研究將槲皮苷藥理活性研究延伸到腫瘤領(lǐng)域，比如Cincin等[3]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮苷具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的作用；李玉英等[4]研究報(bào)道稱，苦蕎來源的異槲皮苷可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，并抑制細(xì)胞增殖和遷移。然而有關(guān)其具體作用機(jī)制尚不明確。PI3K/AKT信號(hào)通路是參與細(xì)胞多重生命活動(dòng)的關(guān)鍵細(xì)胞信號(hào)通路，在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中起著重要作用。據(jù)報(bào)道，在很多腫瘤中(包括胃癌)均發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)通路的過度激活[5-7]。因此，本研究擬采用PI3K/AKT激動(dòng)劑胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)干預(yù)PI3K/AKT信號(hào)通路，以探討槲皮苷對人胃癌細(xì)胞SGC7901凋亡影響的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料與儀器

人胃癌細(xì)胞株SGC7901細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。槲皮苷(純度≥98%)購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；IGF-1購自PeproTech；MTT和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購自Sigma；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和細(xì)胞周期檢測試劑盒均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；兔抗人cleaved caspase-3 多克隆抗體、兔抗人PI3K單克隆抗體和兔抗人AKT多克隆抗體購自Cell signaling technology；羊抗人p-PI3K (Tyr508) 多克隆抗體購自Santa；鼠抗人p-AKT(Ser473)多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔抗人GAPDH多克隆抗體購自杭州賢至生物有限公司。SDS-PAGE電泳儀(北京六一儀器廠)；5415R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Eppendorf)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD)；Multiskan MK3酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人胃癌細(xì)胞株SGC7901在含10%的胎牛血清、100 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素的DMEM培養(yǎng)液中生長，并置于37 ℃、5% CO2、相對飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)，待單層細(xì)胞生長至90%左右的密度時(shí)，使用0.25%的胰酶消化傳代。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求分為：(1)對照組(control組，不加藥處理)；(2)槲皮苷組(quercitrin組，200 μmol/L槲皮苷處理)；(3)IGF-1組(100 μg/L IGF-1處理);(4)槲皮苷+IGF-1組(quercitrin+IGF-1組，200 μmol/L槲皮苷+100 μg/L IGF-1 共處理)，處理時(shí)間為48 h。

2.2MTT法檢測細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期的SGC7901細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108/L，接種于96孔板，37 ℃培養(yǎng)過夜。采用不同濃度的槲皮苷(0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L和400 μmol/L)處理細(xì)胞24 h、48 h和72 h；用不同濃度的IGF-1(0 μg/L、25 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、150 μg/L和200 μg/L)處理SGC7901細(xì)胞48 h。加藥培養(yǎng)結(jié)束后，在避光條件下每孔分別加入10 μL MTT，37 ℃培養(yǎng)4 h，然后吸出培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO振蕩10 min，待紫色甲臜顆粒充分溶解后，置于酶標(biāo)儀上測波長為568 nm處的吸光度(A)值，取均值計(jì)算細(xì)胞相對活力,細(xì)胞相對活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%，并采用SPSS 16.0軟件Probit回歸模型計(jì)算槲皮苷對SGC7901細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

2.3AnnexinⅤ/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的SGC7901細(xì)胞，以每孔1×104個(gè)接種于6孔板中，細(xì)胞分組加藥處理48 h后，用0.25%胰酶(不含EDTA)消化細(xì)胞，消化結(jié)束后收集細(xì)胞，1 500 r/min 離心5 min 去上清；用預(yù)冷的PBS將細(xì)胞洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/L，經(jīng)離心、洗滌后加入500 μL孵育緩沖液懸細(xì)胞，加5 μL Annexin V-FITC混勻，再加5 μL PI充分混勻，避光孵育15 min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4Western blot 檢測蛋白表達(dá) 細(xì)胞分組加藥處理48 h后，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)基收集細(xì)胞，用預(yù)冷的1×PBS洗滌細(xì)胞2次，移至1.5 mL EP管中，4 ℃、13 000 r/min離心1 min，棄上清留細(xì)胞沉淀。按比例加入RIPA蛋白裂解緩沖液，冰上裂解30 min；每隔10 min將裂解液渦旋振蕩1次；4 ℃、13 000 r/min，離心20 min，收集上清，然后通過BCA法測上清液中蛋白濃度。取25 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，待目的蛋白充分分離后停止電泳，取出凝膠用蒸餾水適當(dāng)漂洗后轉(zhuǎn)印于PVDF膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束，將膜泡于含50 g/L脫脂奶粉的TBST中封閉1 h，分別加入抗cleaved caspase-3 多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人PI3K單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人AKT多克隆抗體(1∶1 000)，羊抗人p-PI3K (Tyr 508) 多克隆抗體(1∶2 000)、鼠抗人p-AKT(Ser473)多克隆抗體(1∶1 000)和兔抗人GAPDH多克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，再在室溫下用Ⅱ抗孵育2 h，加 ECL顯影液，用ImageQuant LAS 4000化學(xué)發(fā)光成像儀(GE Healthcare)曝光成像。采用BandScan 圖像分析軟件分析，以目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值的比值來表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過 SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 槲皮苷和IGF-1對SGC7901細(xì)胞活力的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示，隨著槲皮苷濃度的升高，SGC7901細(xì)胞活力逐漸降低，具有劑量依賴性。當(dāng)槲皮苷處理濃度為400 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力最低(P<0.05)。經(jīng)計(jì)算槲皮苷作用48 h的IC50值為275.40 μmol/L。選擇200 μmol/L槲皮苷分別處理SGC7901細(xì)胞24 h、48 h和72 h，細(xì)胞活力無顯著性差異，見圖1。綜合考慮，將選擇200 μmol/L的槲皮苷作用于SGC7901細(xì)胞48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。隨著IGF-1濃度的升高，細(xì)胞活力逐漸上升，當(dāng)IGF-1濃度為100、150和200 μg/L時(shí)與0 μg/L比較細(xì)胞活力有顯著差異(P<0.05)，見圖2。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將采用100 μg/L IGF-1處理細(xì)胞。

Figure 1.The effect of quercitrin on the viability of SGC7901 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 μmol/L group.

Figure 2.The effect of IGF-1 on the viability of SGC7901 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 μg/L group.

2 槲皮苷對SGC7901細(xì)胞凋亡的影響

AnnexinⅤ/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果示，采用200 μmol/L槲皮苷處理SGC7901細(xì)胞48 h后，quercitrin組細(xì)胞凋亡率顯著高于control組(P<0.05);若200 μmol/L槲皮苷與100 μg/L IGF-1共處理SGC7901細(xì)胞48 h，結(jié)果顯示quercitrin+IGF-1組細(xì)胞凋亡率顯著低于quercitrin組(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，與control組比較，200 μmol/L槲皮苷處理SGC7901細(xì)胞48 h可顯著上調(diào)cleaved caspase-3的表達(dá)(P<0.05)；而與quercitrin組比較,槲皮苷與IGF-1共處理SGC7901細(xì)胞， quercitrin+IGF-1組cleaved caspase-3表達(dá)則又顯著降低(P<0.05)，見圖4。

3 槲皮苷抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活

Western blot結(jié)果顯示，與control組比較，200 μmol/L槲皮苷處理SGC7901細(xì)胞48 h可顯著降低p-AKT和p-PI3K的水平(P<0.05)，而對于AKT和PI3K的表達(dá)無影響；而與control組比較，100 μg/L IGF-1處理可顯著提高p-AKT和p-PI3K的水平(P<0.05)。200 μmol/L槲皮苷與100 μg/L IGF-1共處理SGC7901細(xì)胞48 h后，與quercitrin組比較， quercitrin+IGF-1組p-AKT和p-PI3K水平顯著增加(P<0.05)，見圖5。

Figure 3.Quercitrin promoted apoptosis of SGC7901 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs quercitrin group.

Figure 4.Quercitrin induced the activation of caspase-3. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control group; #P<0.05 vs quercitrin group.

討 論

胃癌是源于上皮的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率，一般多見于中年以后的男性。早期診斷相對困難，而待確診時(shí)大多數(shù)已是癌癥晚期，并且腫瘤細(xì)胞對放化療極易產(chǎn)生抗性。因此，從植物中尋找高效的天然抗腫瘤藥物成為近年來熱門的研究方向。槲皮苷是一種廣泛存在于植物中的黃酮類單體化合物，具有多種藥理活性，并且還具有成本低、毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)。近期有研究發(fā)現(xiàn)其可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡[4]，因此，槲皮苷可能在胃癌藥物治療方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體細(xì)胞在正常生理或病理狀態(tài)下發(fā)生的一種由基因控制的程序化死亡過程，是一種主動(dòng)過程，涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等。許多天然抗癌藥物都可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而達(dá)到抑制腫瘤生長的目的[8-9]。本研究結(jié)果顯示，槲皮苷可濃度依賴性地抑制胃癌細(xì)胞株SGC7901的存活，說明槲皮苷對SGC7901細(xì)胞具有一定的殺傷作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，槲皮苷可誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡。同時(shí)，Western blot結(jié)果也證實(shí)，槲皮苷可誘導(dǎo)caspase-3激活，切割形成有活性的cleaved caspase-3，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。說明，槲皮苷可以誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞發(fā)生凋亡。然而，對于槲皮苷誘導(dǎo)胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究鮮有報(bào)道。

Figure 5.Quercitrin inhibited the activation of PI3K/AKT signaling pathway. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs quercitrin group.

PI3K/AKT信號(hào)通路是參與多重生命活動(dòng)的關(guān)鍵信號(hào)通路，在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中起著重要作用。有研究表明，PI3K/AKT信號(hào)通路與胃癌的發(fā)生、生長以及化療耐藥都有密切的關(guān)系[10]。PI3K/AKT信號(hào)通路的激活受多因素調(diào)節(jié)，活化的PI3K可以通過激活下游AKT的活化，活化的AKT通過磷酸化作用激活其下游與抗凋亡相關(guān)的靶蛋白Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡作用[11]。IGF-1是一個(gè)由70多個(gè)氨基酸組成的堿性蛋白質(zhì)，對機(jī)體生長發(fā)育起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。IGF-1可以使PI3K發(fā)生磷酸化而激活，并且引起下游AKT的磷酸化，常被作為PI3K/AKT通路的激動(dòng)劑[12-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單獨(dú)采用IGF-1處理SGC7901細(xì)胞，并不能引起SGC7901細(xì)胞顯著凋亡，而采用IGF-1與槲皮苷共處理SGC7901細(xì)胞，則能顯著抑制槲皮苷誘導(dǎo)的SGC7901細(xì)胞凋亡，亦顯著抑制cleaved-caspase-3的表達(dá)。說明IGF-1可以抵消槲皮苷對SGC7901細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。另外，槲皮苷可顯著抑制p-AKT和p-PI3K的表達(dá)，說明槲皮苷處理可顯著抑制SGC7901細(xì)胞中PI3K/AKT信號(hào)通路的活化，然而這種抑制作用可以被IGF-1所抵消。提示，槲皮苷誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞發(fā)生凋亡可能是通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，槲皮苷可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株SGC7901細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機(jī)制可能是槲皮苷可抑制PI3K/AKT信號(hào)通路激活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。由此推斷，阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡可能是槲皮苷抗腫瘤作用的分子作用機(jī)制之一。