降香黃檀組織培養(yǎng)技術(shù)研究

楊衛(wèi)星

摘要 以降香黃檀種子為材料，通過組織培養(yǎng)誘導不定芽。結(jié)果表明，以種子為材料組培較莖段組培更易成活，可以形成完整的組培再生植株，并獲得了降香黃檀誘導、增殖和生根的適宜配養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。

關(guān)鍵詞 降香黃檀；組織培養(yǎng)；誘導

中圖分類號 Q94 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）10-0150-02

Study on Tissue Culture Techniques of Dalbergia odorifera

YANG Wei-xing

（Guangxi Paiyangshan State Forest Farm，Ningming Guangxi 532500）

Abstract Using Dalbergia odorifera as the material，through tissue culture induced adventitious bud.The results showed that compared with stem section，the seed as the material could be more likely to survive，formed a complete seed regeneration plant，and got the optimum media and culture conditions for the induction，proliferation and rooting of Dalbergia odorifera.

Key words Dalbergia odorifera；tissue culture；induction

降香黃檀（Dalbergia odorifera）原產(chǎn)于我國海南，是我國重要的珍貴商品用材林樹種，具有非常高的商品價值和藥用價值，因其根部有固氮菌，冬季落葉量大，可有效改善土壤，生態(tài)效益優(yōu)良，同時也是極具開發(fā)潛力的城市園林綠化優(yōu)良樹種[1-2]。近年來，由于降香黃檀具有較高的經(jīng)濟價值而被大量砍伐，導致其天然林現(xiàn)已殘存不多，瀕臨滅絕，屬亟待拯救保存的特有瀕危藥用植物[3]。其種質(zhì)來源參差不齊、優(yōu)劣混雜，良種選育和豐產(chǎn)栽培技術(shù)的研究工作尚不成熟，種源引進量少且混雜不清，許多生產(chǎn)技術(shù)問題尚未得到解決，亟須發(fā)展種質(zhì)資源基因庫，擴大樹種間的遺傳多樣性，建立完善實用的豐產(chǎn)栽培技術(shù)體系[4]。

降香黃檀繁殖方式以播種為主，扦插或嫁接為輔，導致苗木品質(zhì)參差不齊，或繁育系數(shù)較低，嚴重制約了規(guī)范化種植的效果和良種規(guī)?；茝V[5]。降香黃檀組培快繁技術(shù)有助于解決良種缺乏等諸多問題，通過組培技術(shù)可保持單株優(yōu)良特性，達到優(yōu)良遺傳材料快速繁殖（良種快繁）、脫毒良種苗和無病毒苗大量繁殖、特殊育種材料快速繁殖、基因工程植株快速繁殖和離體種子快速繁殖的目的，建立種質(zhì)資源基因庫，收集和保存優(yōu)良品系，推動降香黃檀相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，此項技術(shù)研究鮮少報道，正處于起步階段，有待于進一步研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗以降香黃檀當年種子（Dalbergia odorifera）為材料，原產(chǎn)地海南。

試驗所用的組培高效抑菌劑愛力克和益培靈購自上海宇涵生物科技有限公司。二者皆是新型組織培養(yǎng)專用防污染殺菌劑，其作用機理是穿透微生物的細胞壁進入細胞內(nèi)部，干擾復制或通過斷開微生物關(guān)鍵蛋白質(zhì)的鍵而起到殺菌作用。

1.2 試驗設計

試驗設計見表1。3次重復，數(shù)據(jù)取3次重復的平均值。處理A、B、C、D用愛力克進行外植體消毒的時間分別為10、20、10、20 min。

所有培養(yǎng)基pH值為5.5～5.6，在121 ℃高溫條件下滅菌15 min后備用。試驗以飽滿無皺縮的降香黃檀種子作為外植體，用飽和洗衣粉溶液刷洗干凈后備用，滅菌后將外植體接種到培養(yǎng)基上，置于光強3 000 lx、溫度25 ℃條件下培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒階段

從表2可以看出，污染率與愛立克處理濃度成反比，灼傷率則成正比。處理D污染率最低，其他3個處理分別是處理D的4.6、4.1、1.6倍，處理濃度比處理時間抑菌效果更顯著。而灼傷率則是處理A最低，其他處理比處理A分別高出33.3%、8.3%、75.0%。說明灼傷率除了與愛立克濃度有關(guān)外，還與處理時間成正比，時間越長，灼傷越嚴重。根據(jù)試驗結(jié)果可以看出，以處理C最為適宜，污染率和灼傷率均在最佳范圍。灼傷率過高，苗木萌發(fā)后更容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。在外植體消毒階段，愛力克具有明顯的消毒效果，可有效降低污染率，提高外植體誘導試驗的成效，與此同時，愛力克對降香黃檀種子具有一定的傷害。因此，要把握好處理的濃度和時間，避免出現(xiàn)過高的灼傷率。如果褐化情況嚴重，可在1%氯化汞滅菌時，將5 min滅菌過程分為2次2.5 min滅菌，中間用無菌水清洗數(shù)次，對褐化、灼傷現(xiàn)象有較明顯的抑制作用，對滅菌效果影響不大。

2.2 外植體誘導階段

從表2可以看出，誘導階段處理C萌芽率為91%、污染率為20%，在4個處理中效果最好，降香黃檀誘導階段處理萌芽率分別較其他3個處理高出71.7%、40.0%和16.7%。4個處理的污染率無顯著差異，平均污染率為21.8%，后續(xù)的試驗可以設計試驗方案，尋找抑菌劑益培靈的最佳濃度，將污染率降到最低，進一步提高外植體誘導的成效，以獲得更多的有效芽。在低濃度時，萌芽率與6-BA+NAA濃度成正比，超過一定的濃度，則呈反比。且濃度過高，容易出現(xiàn)愈傷組織，有葉片黃化現(xiàn)象。

2.3 增殖培養(yǎng)階段

從表2可以看出，增殖培養(yǎng)階段處理C增殖個數(shù)為3.9個、莖芽伸長3.8 cm、污染率10%，為最佳配比。處理A的增殖個數(shù)和莖芽伸長均最低，增殖個數(shù)分別比其他3個處理低25.0%、46.2%、32.3%，莖芽伸長分別比其他3個處理低17.2%、36.8%、25.0%。說明在一定范圍內(nèi)，增殖個數(shù)和莖芽伸長隨6-BA+NAA濃度的增加呈遞增趨勢，超過一定的濃度后呈遞減趨勢。4個處理的污染率相差不大，平均值為10%。

2.4 生根培養(yǎng)階段

從表2可以看出，生根培養(yǎng)階段處理B苗高2.9 cm、根長1.5 cm、生根率56%，為最佳方案。較處理A、C、D苗高分別高出38.1%、26.1%、70.6%，根長分別增加87.5%、25.0%、66.7%，生根率分別增加21.7%、14.3%、19.1%；4個處理污染率相差不大，均值為8%。結(jié)果分析表明，降香黃檀生根階段在低濃度范圍內(nèi)上述指標隨IBA+ABT1濃度增加呈遞增趨勢，超過一定濃度后呈現(xiàn)出遞減的趨勢。

3 結(jié)論與討論

獲取無菌材料是進行組織培養(yǎng)的首要步驟，也是最關(guān)鍵的步驟之一。降香黃檀組培以種子為外植體材料，較莖段更易成活，可能的原因是種子有果皮保護，表面菌類少，且容易處理[6]。實際操作時，要注意及時采摘，并選擇3 d晴朗的天氣采摘，組培處理要注重細節(jié)，掌握要領(lǐng)，動作干凈利落，可有效降低污染率[7]。

試驗采用的MS培養(yǎng)基，是廣譜性基本培養(yǎng)基，營養(yǎng)豐富，基礎元素較為全面，基本可以滿足降香黃檀的生長發(fā)育，幼苗表現(xiàn)健壯，長勢良好，葉片嫩綠有光澤。由于降香黃檀本身有固氮作用，因而可適當降低無機鹽濃度。為了防止褐化的發(fā)生，可加入VC，濃度以0.01 g/L為宜。

增殖階段，不同濃度激素對外植體誘導有顯著影響，處理C（益培靈0.1 g/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L）為最佳培養(yǎng)基配方，接種3～5 d后芽開始萌動，7～10 d誘導出芽。試驗發(fā)現(xiàn)，6-BA+NAA激素濃度過高，易發(fā)生畸形并形成白色松散的愈傷組織；濃度過低，又影響萌動，這與其他研究結(jié)果類似[8]。

降香黃檀的生根時間較長，需要20～30 d，且各處理生根率都較低，不能達到理想水平，有待進一步研究。IBA+ABT1濃度過低，表現(xiàn)為生根難、根系短而少；但超過一定的濃度后，則出現(xiàn)愈傷組織，根部發(fā)黑，且有葉片變黃掉落現(xiàn)象。

在植物組培快繁過程中，接種室、培養(yǎng)基、接種器具、超凈工作臺管理不規(guī)范或無菌不嚴格等情況均可導致污染，植物本身也容易滋生大量的微生物，甚至有一些菌絲體可侵入表皮的薄壁組織，不能被一般的表面消毒方法清除，隨著材料帶入培養(yǎng)過程，引起內(nèi)生菌污染。因此，研究微生物污染的種類、來源、消毒方法，篩選新型高效的抑制劑，對減輕污染、提高成功率、降低成本等都有重要意義。

本試驗采用了愛力克和益培靈2種新型組織培養(yǎng)專用抑菌劑，其作用機理均為穿透微生物的細胞壁進入細胞內(nèi)部，與核酸堿基結(jié)合后干擾復制，或通過斷開微生物關(guān)鍵蛋白質(zhì)的鍵，從而迅速殺滅或抑制其生長。滅菌效果顯著，但具體使用劑量以及對植物生長狀況的影響尚不明確，有待于進一步試驗研究。

4 參考文獻

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