紅毛七總皂苷體外抑制乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30增殖的研究

康 圓，樊夢(mèng)瑩，于潤(rùn)澤，王紅英，展穎轉(zhuǎn)

(西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061)

乳腺癌在女性中的發(fā)病率和致死率[1-2]在全球范圍內(nèi)高居第一，嚴(yán)重威脅女性健康。現(xiàn)有的治療方式有手術(shù)治療、化療、放療和內(nèi)分泌治療等。在臨床上，大多數(shù)藥物由于嚴(yán)重的不良反應(yīng)以及耐藥性的產(chǎn)生，治療效果并不盡人意，不能滿足臨床的需要，這給抗乳腺癌藥物的研發(fā)提出了巨大的挑戰(zhàn)。隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、有效成分分離提取以及活性篩選等技術(shù)的發(fā)展，從天然植物中篩選特異性強(qiáng)的新型靶向抗腫瘤藥物，已成為研究開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物的重要途徑。

紅毛七(RadixetRhizomaLeonticis)為小檗科紅毛七屬(CaulophyllumrobustumMaxim)植物，又名葳嚴(yán)仙，其主要藥用部位為干燥根和根莖，常用于跌打損傷、月經(jīng)不調(diào)、胃腹疼痛和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療，主要分布于我國(guó)的東北、西北和西南地區(qū)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紅毛七的主要藥理學(xué)活性成分為生物堿[3]和皂苷，有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抑菌及抗腫瘤等活性。目前采用化學(xué)分離及光譜方法分析鑒定出32種紅毛七三萜皂苷，并確定了其化學(xué)組成[4]。本實(shí)驗(yàn)室成功地從紅毛七中提取總皂苷，對(duì)其抗腫瘤活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)肝癌細(xì)胞及肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用[5]，但在乳腺癌中的作用未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，本研究旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)考察其對(duì)乳腺癌細(xì)胞株ZR-75-30增殖、凋亡及遷移的影響及其作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1儀器 MCO-15AC CO2恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)自日本Sanyo公司；Mini-002-0107自動(dòng)計(jì)數(shù)儀及細(xì)胞計(jì)數(shù)板，購(gòu)自美國(guó)Nexcelom公司；Model 550型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；Cham Chemi Professional全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)，購(gòu)自北京市賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；TS-100多用脫色搖床，購(gòu)自江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2試藥 紅毛七總皂苷由西安交通大學(xué)食品藥品研究與檢測(cè)中心提取分離得到[5];DMEM培養(yǎng)基(干粉) 購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；胎牛血清購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；SDS-PAGE制膠試劑盒購(gòu)自陜西先鋒生物有限公司。

1.3細(xì)胞 人乳腺癌細(xì)胞株ZR-75-30(TCHu203),購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清、100 u·mL-1青霉素與鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)，隔天換液，3～4 d胰酶消化傳代培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2MTT實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，以2×104個(gè)·mL-1接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后加入不同質(zhì)量濃度(0.125，0.187，0.250，0.375，0.500和1.00 mg·mL-1)的紅毛七總皂苷20 μL·孔-1，陰性對(duì)照組加入無(wú)血清培養(yǎng)基，每孔20 μL。分別作用24，48和72 h后，吸棄孔板中的培養(yǎng)基，加入MTT溶液，使其終質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1，37 ℃孵育4～6 h，小心吸去 MTT，每孔加入DMSO 150 μL，搖床上振蕩15 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值A(chǔ)，并計(jì)算細(xì)胞活力。

2.3平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于12孔板(200 個(gè)·孔-1)，待細(xì)胞貼壁后，加入不同質(zhì)量濃度的(0.05，0.01和0.2 mg·mL-1)紅毛七總皂苷，作用7～10 d后，終止培養(yǎng)，棄上清液，用甲醇固定10 min，用PBS緩沖液洗滌2次，采用質(zhì)量濃度為2 g·L-1的結(jié)晶紫染色15 min，后用三蒸水緩慢洗去未結(jié)合的染色液，室溫干燥，于凝膠成像系統(tǒng)下拍照。同時(shí)規(guī)定50個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞集落為1個(gè)克隆。將孔板置于倒置顯微鏡下，選取不同視野計(jì)算不同質(zhì)量濃度藥物作用后的細(xì)胞克隆形成數(shù)。

2.4Hoechst 33258染色 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于12孔板中，貼壁后加入不同質(zhì)量濃度(0.1，0.2和0.4 mg·mL-1)的總皂苷處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入300 μL Hoechst 33258染色液，染色5 min后，用三蒸水沖洗干凈，在340 nm波長(zhǎng)下，觀察細(xì)胞核的形態(tài)并拍照記錄細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算出凋亡比例。

2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于12孔板中，待細(xì)胞密度為80%時(shí)，用滅菌槍頭在各孔中劃一條直線。小心洗去脫離的細(xì)胞及碎片，更換新鮮培養(yǎng)基并給予不同質(zhì)量濃度的紅毛七總皂苷干預(yù)48 h，于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)在顯微鏡下觀察并記錄對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移的距離。

2.6Western Blot實(shí)驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板，貼壁后加入紅毛七總皂苷，使其終質(zhì)量濃度分別為0.1，0.2和0.4 mg·mL-1。作用48 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗 2次，每孔加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30 min；于4 ℃以12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。向蛋白樣品中加入上樣緩沖液，沸水中煮沸變性5 min，待冷卻后將樣品保存于-20 ℃?zhèn)溆谩悠方?jīng)質(zhì)量濃度為100 g·L-1的SDS-PAGE 膠電泳分離，加入相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗(稀釋比例為1∶20 000)，在37 ℃孵育1 h，用TBST緩沖液沖洗4次，每次5 min。ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)條帶，用蛋白灰度分析軟件Image-Pro Plus分析各條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，確定目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1紅毛七總皂苷抑制ZR-75-30細(xì)胞的增殖 采用MTT法考察紅毛七總皂苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30增殖的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的紅毛七總皂苷(0.125，0.187，0.250，0.375，0.500和1.00 mg·mL-1)作用24，48和72 h時(shí)，對(duì)細(xì)胞的增殖均表現(xiàn)出抑制作用。統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析得到，在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)值依次為0.539 1，0.348 2和0.259 6 mg·mL-1，且抑制率隨著藥物質(zhì)量濃度的增加和孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，具有明顯的時(shí)間和劑量依賴性，見(jiàn)圖1。

圖1紅毛七總皂苷對(duì)ZR-75-30細(xì)胞增殖的抑制作用

Fig.1 Inhibitory effect of RLTS on ZR-75-30 cells

通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與對(duì)照組相比，給藥組克隆形成數(shù)量顯著降低，且單個(gè)克隆中的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，呈現(xiàn)劑量依賴性。由此可知，紅毛七總皂苷能顯著抑制ZR-75-30細(xì)胞的增殖，見(jiàn)圖2。

3.2紅毛七總皂苷能夠誘導(dǎo)ZR-75-30細(xì)胞凋亡 由Hoechst 染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，給藥組細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加，且隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢(shì)，不同質(zhì)量濃度(0，0.1，0.2和0.4 mg·mL-1)的紅毛七總皂苷給藥組細(xì)胞的凋亡比例依次為0.82%，2.00%，2.57%和14.50%。同時(shí) Western Blot 結(jié)果表明，隨著給藥質(zhì)量濃度的增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，凋亡標(biāo)志性蛋白Cleaved-Caspase-3和Cleaved PARP的表達(dá)量明顯增多(P<0.05)，其中質(zhì)量濃度為0.4 mg·mL-1的紅毛七總皂苷與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

圖2紅毛七總皂苷對(duì)ZR-75-30平板克隆形成的影響(n=3)

A.平板克??；B.平板克隆數(shù)統(tǒng)計(jì)。

注：與對(duì)照組比較**P<0.01。

Fig.2 Effect of RLTS on colony formation of ZR-75-30 cells (n=3)

A.colony formation；B.the statistics analysis of colones.

Note：**P<0.01 vs control group.

圖3紅毛七總皂苷對(duì)ZR-75-30細(xì)胞凋亡的影響(n=3)

A.Hoechst染色；B.A圖統(tǒng)計(jì)；C.細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；D.C圖統(tǒng)計(jì)。

注：與對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.01。

Fig.3 Effect of RLTS on apoptosis of ZR-75-30 cells (n=3)

A.Hoechst assay；B.the quantification of A；C.Western Blot analysis of apoptosis-related protein expression；D.the quantification of C.

Note：*P<0.05,**P<0.01 vs control group.

3.3紅毛七總皂苷對(duì)ZR-75-30細(xì)胞遷移能力的影響 通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察不同質(zhì)量濃度紅毛七總皂苷作用48 h后對(duì)乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30遷移能力的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陰性對(duì)照組中細(xì)胞遷移速度較快，在48 h處劃痕已接近完全愈合。在藥物處理組中，細(xì)胞遷移明顯受到抑制，并隨著質(zhì)量濃度的增大遷移距離逐漸縮短，表明紅毛七總皂苷能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30的遷移(P<0.01)，且呈劑量依賴性。同時(shí)，Western Blot 結(jié)果表明，隨著給藥劑量的增加，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)，見(jiàn)圖4。

圖4紅毛七總皂苷對(duì)ZR-75-30細(xì)胞遷移的影響(n=3)

A.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)圖；B.A圖統(tǒng)計(jì)；C.細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)；D.C圖統(tǒng)計(jì)。

注：與對(duì)照組相比*P<0.05,**P<0.01。

Fig.4 Effect of RLTS on migration of ZR-75-30 cells (n=3)

A.the graph of wound scratch assay；B.the quantification of A；C.Western Blot analysis of migration-related protein expression；D.the quantification of C.

Note：*P<0.05,**P<0.01 vs control group.

4 討論

1981～2010年開(kāi)發(fā)的新型抗腫瘤藥物中，79.8%新型抗腫瘤藥物均來(lái)自天然產(chǎn)物或是以天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)合成的[6]，紅毛七是中國(guó)傳統(tǒng)中藥材，而皂苷類化合物是一種在自然界植物中發(fā)現(xiàn)的成分，由于其具有多種藥理作用，在許多植物中被認(rèn)為是生物活性成分。本實(shí)驗(yàn)成功分離出總皂苷，采用MTT法對(duì)其抗癌活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，紅毛七總皂苷能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30的增殖，且呈劑量和時(shí)間依賴性。

在正常情況下，細(xì)胞增殖與細(xì)胞死亡間保持著動(dòng)態(tài)平衡，這種平衡是維持多細(xì)胞生物自身穩(wěn)定的重要因素，細(xì)胞增殖失控或細(xì)胞凋亡受阻均可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。而細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序化死亡的一種方式，是機(jī)體免疫自穩(wěn)和免疫監(jiān)視功能的重要組成部分，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及藥物治療有重要影響[7]?，F(xiàn)有研究表明，線粒體在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中扮演著重要的角色[8-9]，在凋亡因子的刺激下，引發(fā)線粒體外膜透化，激活半胱氨酸蛋白酶(Caspase)介導(dǎo)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞形態(tài)和功能的改變，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其中Caspase-3是其關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白，PARP是其重要的作用底物，而Cleaved-Caspase-3是Caspase-3經(jīng)剪切后產(chǎn)生的活性片斷，其表達(dá)程度可反映Caspase-3的活性和凋亡情況。正常情況下，Caspase-3以無(wú)活性的Caspase-3酶原(Procaspase-3)形式存在，當(dāng)受到機(jī)體內(nèi)部或外界因素刺激時(shí)被激活，Caspase-3酶原裂解為活性體，激活凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。從Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，隨著給藥劑量的增加，Cleaved-Caspase-3和Cleaved PARP的表達(dá)量明顯增多。由此推測(cè)，細(xì)胞的凋亡可能是通過(guò)下調(diào)與線粒體凋亡途徑密切相關(guān)的抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而活化凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3，上調(diào)Cleaved-Caspase-3，裂解PARP，阻礙DNA損傷修復(fù)，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，90%的癌癥死亡是由癌癥轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的[10]，而腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特征，是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過(guò)程。基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的生理動(dòng)態(tài)平衡是防止腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的一道天然屏障?；|(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)是一組能夠降解ECM的鋅離子依賴型內(nèi)肽酶，在惡性腫瘤內(nèi)，MMPs主要由間質(zhì)細(xì)胞以無(wú)活性酶原的形式分泌。MMPs活化后，可通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)宿主ECM的降解、控制腫瘤新生血管生成、調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)以及調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，直接或間接參與多種生理及病理過(guò)程[11]。明膠酶類的MMP-2和MMP-9在腫瘤組織中的高表達(dá)已被大多數(shù)研究所證實(shí)[12-13]，本研究中給藥組MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量均顯著下調(diào)，表明紅毛七總皂苷可能是通過(guò)下調(diào)乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)，從而抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移。本研究證明了紅毛七總皂苷具有良好的體外抗腫瘤活性，并確定了其作用機(jī)制，其主要發(fā)揮抗腫瘤作用的單體活性成分尚不明確，有待進(jìn)一步研究。