張金漢,何萬領(lǐng),徐廷生,李曉麗,楊龍幫
(河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院,生物飼料與精準(zhǔn)營養(yǎng)實驗室,河南洛陽 471023)
肝臟和腎臟分別是動物體內(nèi)最大的分解和合成器官、排泄器官,肝腎對雞蛋的形成及整個產(chǎn)蛋周期的維持具有十分重要的作用[1]。然而,在現(xiàn)代集約化蛋雞生產(chǎn)中,密集的飼養(yǎng)環(huán)境和高強度的生產(chǎn)過程對蛋雞肝臟和腎臟的應(yīng)激加大,造成產(chǎn)蛋周期縮短,死淘增加現(xiàn)象普遍。人類中醫(yī)藥學(xué)研究證實,肝臟、腎臟等臟腑與生殖關(guān)系密切[2]。調(diào)控肝腎機能將有望提高蛋雞生產(chǎn)性能,延長產(chǎn)蛋周期。
隨著抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的逐漸禁用,中草藥以其無毒副作用、無殘留、無抗藥性,且活性成分多樣,具有綜合調(diào)理和預(yù)防疾病的功能,在畜禽生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。一些補肝益腎類中草藥將有望在改善產(chǎn)蛋后期蛋雞肝臟和腎臟機能、延長其生長周期、降低死淘率等方面發(fā)揮重要作用。為此,本試驗選用女貞子、巴戟天、菟絲子、白芍、當(dāng)歸、五味子、杜仲、淫羊藿、枸杞、牛膝、黃芪、川斷、山須臾等16種補肝益腎類中藥原料,根據(jù)中藥配伍原則,結(jié)合蛋雞生理特點,自擬4個補益肝腎中藥復(fù)方,研究其對蛋雞生產(chǎn)性能、肝腎抗氧化性能及生殖激素分泌的影響,為補肝益腎類中藥飼料添加劑的開發(fā)與應(yīng)用提供試驗依據(jù)。
1.1 中草藥添加劑復(fù)方制備 女貞子、巴戟天、菟絲子、白芍、當(dāng)歸、五味子、杜仲、淫羊藿、枸杞、牛膝、黃芪、川斷、山須臾等16種補肝益腎類中藥材購自洛陽市關(guān)林中藥材市場,經(jīng)除雜、干燥、粉碎后過60目篩。將16種中草藥根據(jù)中藥配伍原則,結(jié)合蛋雞生理特點組成4個補益肝腎中草藥添加劑復(fù)方。復(fù)方1:女貞子、巴戟天、枸杞、牛膝等;復(fù)方2:白芍、淫羊藿、菟絲子、杜仲等;復(fù)方3:女貞子、淫羊藿、熟地黃、牛膝等;復(fù)方4:白芍、巴戟天、菟絲子、枸杞等。
1.2 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理 將400只健康且體重均勻的60周齡海蘭褐蛋雞隨機分成5組,分別為對照組和試驗 Ⅰ、ⅠⅠ、ⅠⅠⅠ 、ⅠV 組。每組 4個重復(fù),每個重復(fù) 20只雞。每天08:00和16:00各喂1次料,采用自然光照和人工光照相結(jié)合的方法保證每天16 h連續(xù)光照。試驗全期蛋雞自由采食與飲水,定期對雞舍進行衛(wèi)生管理和消毒。預(yù)試期7 d,正試期42 d。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧(原料組成及營養(yǎng)成分見表1),試驗Ⅰ、ⅠⅠ、ⅠⅠⅠ和ⅠV組分別在基礎(chǔ)日糧中添加1%的補益肝腎中藥添加劑復(fù)方1、復(fù)方2、復(fù)方3和復(fù)方4,從而制成含不同中藥復(fù)方的試驗日糧。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)成分(風(fēng)干基礎(chǔ))
1.3 樣品采集 在試驗第42天禁食,12 h后每個重復(fù)隨機取4只雞,用一次性真空采血管于翅下靜脈采集血液5 mL,傾斜靜置10 min,3 000 r/min 離心8 min,分離獲得血清。采血完畢將蛋雞處死,解剖,取肝臟、腎臟組織,用以抗氧化指標(biāo)的測定。
1.4 指標(biāo)測定
1.4.1 生產(chǎn)性能 試驗期間,每周以重復(fù)為單位記錄蛋雞產(chǎn)蛋量、耗料量和不良蛋數(shù)(臟蛋、沙皮蛋、軟皮蛋、血斑蛋等),并計算產(chǎn)蛋率、平均蛋重、平均日采食量、料蛋比和不良蛋率。
1.4.2 蛋品質(zhì) 在試驗第42天,每個重復(fù)隨機取4枚雞蛋,使用游標(biāo)卡尺測量雞蛋的縱軸、橫軸,計算蛋形指數(shù)(蛋形指數(shù)=縱軸/橫軸);用蛋殼強度儀(Ⅰn-Spec 2200,美國ⅠNSTRON公司)、螺旋測微器(Mitutoyo103-137,日本三豐公司)和蛋品質(zhì)測定系統(tǒng)(EMT5200,日本Robotmation公司)測定雞蛋的蛋殼顏色、蛋殼強度、蛋殼厚度、蛋白高度和哈夫單位等蛋品質(zhì)指標(biāo)。
1.4.3 生殖激素 采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELⅠSA)測定血清樣品中雌二醇(E2)、促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)的水平,具體操作步驟按說明書進行。酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所,貨號分別為E2(H102)、FSH(H101)、LH(H206)。
1.4.4 肝臟、腎臟抗氧化指標(biāo) 取肝臟、腎臟組織各0.5 g,按重量(g):體積(mL)為1:9的比例加入冷的生理鹽水,在冰水浴條件下經(jīng)組織研磨儀(COYOTE G50)研磨成10%的肝臟、腎臟組織勻漿液,2 500 r/min離心10 min后取上清液進行抗氧化指標(biāo)檢測。使用試劑盒測定組織勻漿上清液中總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA),按說明書具體操作步驟進行測定。試劑盒購自南京建成生物工程研究所,測試盒貨號分別為T-AOC(A015)、SOD(A001-1)、GSH-Px(A005)、CAT(A007-1)、MDA(A003-1)。
1.5 統(tǒng)計分析 用Excel 進行初步數(shù)據(jù)處理,采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件中的One-Way ANNOVA的運算模塊進行單因素方差分析,用Duncan's法進行多重比較。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示,以P<0.05表示差異顯著。
2.1 補益肝腎中草藥添加劑對蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)的影響 如表2所示,4種補肝腎復(fù)方中草藥飼料添加劑對蛋雞的平均日采食量無顯著影響(P>0.05);與對照相比,試驗Ⅰ、ⅠⅠ、ⅠⅠⅠ、ⅠV組產(chǎn)蛋率分別顯著提高了7.73%、23.90%、17.91%和20.75%(P<0.05);試驗ⅠⅠ組的平均蛋重最大,顯著高于對照組和其他中草藥復(fù)方組(P<0.05);與對照組相比,試驗 ⅠⅠ、ⅠⅠⅠ組和 ⅠV組料蛋比顯著降低(P<0.05),試驗ⅠⅠ、ⅠV組的不良蛋率顯著降低(P<0.05)。
由表3可知,與對照組相比,試驗ⅠⅠ組和ⅠV組的蛋殼顏色顯著變深(P<0.05);各中草藥復(fù)方組雞蛋蛋白高度和哈夫單位分別較對照組提高了17.07%(P<0.05)、11.20%(P<0.05)、25.05%(P<0.05)、5.12%(P>0.05)和11.63%(P<0.05)、10.31%(P<0.05)、16.69%(P<0.05)、6.90%(P>0.05);與對照組相比,各復(fù)方組蛋殼強度和蛋形指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。
2.2 補益肝腎中藥添加劑對蛋雞肝臟和腎臟抗氧化性能的影響 由表4可知,與對照組相比,試驗Ⅰ組腎臟GSH-Px顯著提高(P<0.05),但肝臟和腎臟的其他抗氧化指標(biāo)與對照組差異不顯著(P>0.05);試驗ⅠⅠ組蛋雞肝臟和腎臟中T-AOC、SOD、GSH-Px和CAT活性顯著升高(P<0.05);試驗ⅠⅠⅠ組SOD和CAT活性顯著升高(P<0.05);試驗ⅠV組肝臟T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT活性和腎臟SOD、GSH-Px、CAT活性顯著升高(P<0.05);與對照組相比,試驗 ⅠⅠ、ⅠⅠⅠ和ⅠV組肝臟MDA水平和ⅠⅠ組腎臟MDA水平均顯著下降(P<0.05)。
表2 補益肝腎中草藥添加劑對產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能的影響
表3 補益肝腎中草藥飼料添加劑對產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋品質(zhì)的影響
表4 補益肝腎中藥添加劑對產(chǎn)蛋后期蛋雞肝臟、腎臟抗氧化性能的影響
表5 補益肝腎中藥添加劑對產(chǎn)蛋后期蛋雞血清生殖激素的影響
2.3 補益肝腎中藥添加劑對蛋雞生殖激素的影響 如表5所示,與對照組相比,中藥添加劑各組蛋雞血清FSH水平顯著升高(P<0.05),試驗ⅠⅠ組和ⅠV組顯著高于試驗ⅠⅠⅠ組(P<0.05);試驗ⅠⅠ組E2水平顯著高于對照組和試驗ⅠⅠⅠ組(P<0.05),LH水平顯著高于其他各中藥試驗組(P<0.05);試驗Ⅰ組E2和LH水平與對照組無顯著差異(P>0.05)。
3.1 補益肝腎中草藥添加劑對蛋雞生產(chǎn)性能的影響 大量研究表明,隨著蛋雞生產(chǎn)周期的延長,肝臟分解與合成能力降低,腎氣衰弱,進而引起生殖器官衰退,生產(chǎn)性能逐漸下降[3-4]。本試驗發(fā)現(xiàn),與對照組相比,4個補益肝腎中草藥復(fù)方均不同程度地提高了蛋雞產(chǎn)蛋率、降低料蛋比和不良蛋率,其中以白芍、淫羊藿和菟絲子等組成的中草藥添加劑復(fù)方(復(fù)方2)效果最好;在改善蛋品質(zhì)方面,補益肝腎中藥添加劑對蛋雞蛋殼顏色、蛋白高度、哈夫單位、蛋殼強度和蛋殼厚度均有改善作用,其中戈貞子、淫羊藿和熟地黃等組成的復(fù)方(復(fù)方3)效果最為理想。這一結(jié)果可能原因:一方面補益肝腎中草藥添加劑通過改善產(chǎn)蛋后期蛋雞肝腎機能而間接調(diào)控蛋雞的生產(chǎn)性能;另一方面補益肝腎中草藥添加劑中活性成分可能對蛋雞生殖器官產(chǎn)生直接作用?,F(xiàn)代中醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),補肝益腎類中草藥能夠改善人類生殖機能障礙[2,5]。研究表明,肝臟合成的膽固醇、甘油三酯等與載脂蛋白結(jié)合形成極低密度脂蛋白(VLDL)運輸?shù)铰殉仓?,促進蛋黃形成,相反,肝臟機能異常時,蛋黃形成受阻,產(chǎn)蛋性能下降[6]。蛋品質(zhì)是衡量蛋雞生產(chǎn)性能的又一重要指標(biāo)。其中,蛋殼質(zhì)量是產(chǎn)蛋后期蛋雞蛋品質(zhì)下降最嚴(yán)重的指標(biāo)之一,鈣吸收利用率降低是影響蛋殼質(zhì)量的主要因素[7]。研究表明,鈣吸收利用受肝、腎合成1,25-二羥基膽鈣化醇的影響,一方面,1,25-二羥基膽鈣化醇通過VD(VDR)受體介導(dǎo)的基因組使小腸黏膜鈣結(jié)合蛋白-D9k增加而促進鈣吸收[8];另一方面,1,25-二羥基膽鈣化醇可增加鈣-ATP酶的活性,從而增強鈣向血液中的轉(zhuǎn)運[9]。本試驗中,飼料中鈣含量為3.2%,略低于蛋雞對鈣的營養(yǎng)需要量,這可能是造成各組生產(chǎn)水平偏低的原因之一。但中藥添加組的產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)較對照組有所提高和改善,這可能與補肝益腎中藥增加了鈣的轉(zhuǎn)運、吸收有關(guān),具體有效物質(zhì)和作用機理有待于進一步研究。
3.2 補益肝腎中草藥添加劑對蛋雞肝腎抗氧化性能的影響 動物機體內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生、利用與清除維持著動態(tài)平衡,當(dāng)機體ROS產(chǎn)生和抗氧化體系失衡時,可引起氧化應(yīng)激,進而導(dǎo)致機體內(nèi)脂質(zhì)、蛋白、核酸等大分子過氧化,影響機體健康和生產(chǎn)性能[10]。因此,SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC等抗氧化酶類含量和活力及氧化代謝產(chǎn)物MDA水平往往被用作評價機體組織器官機能的重要指標(biāo)[11]。本試驗結(jié)果顯示,在產(chǎn)蛋后期蛋雞日糧中添加補肝益腎中草藥添加劑能夠提高肝臟和腎臟T-AOC的量以及SOD、GSH-Px、CAT的活性,降低了MDA水平。這表明補益肝腎中草藥復(fù)方能夠通過提高肝臟和腎臟抗氧化能力而達(dá)到補肝益腎的作用,這與馬春陽等[12]報道的結(jié)果相似。中草藥成分復(fù)雜,活性物質(zhì)多樣,其中多糖、黃酮類等生物活性物質(zhì)被證明能夠有效提高動物機體抗氧化水平。研究表明,補肝益腎中草藥具有增加肝臟和腎臟的血流量,改善血管微循環(huán)系統(tǒng),促進損傷細(xì)胞修復(fù),增強細(xì)胞內(nèi)氧化自由基的清除能力[13]。季麗萍[14]通過給大鼠灌服含熟地黃、枸杞等補腎中藥制劑,發(fā)現(xiàn)能增加大鼠的心肌收縮力,增加心肌供氧,并且減少了自由基的生成、降低了對細(xì)胞膜的損害。史東輝等[15]研究發(fā)現(xiàn),復(fù)方中草藥制劑可通過調(diào)控蛋雞肝臟和腎臟組織中抗氧化酶mRNA的表達(dá)而明顯提高蛋雞腎臟、肝臟的抗氧化能力。本試驗中,4個補益肝腎中草藥復(fù)方對肝腎抗氧化性能的作用效果不一,這可能與各中藥活性成分發(fā)揮作用的通路不同有關(guān),其具體作用機制有待進一步研究。
3.3 補益肝腎中草藥添加劑對蛋雞生殖激素的影響 蛋雞產(chǎn)蛋是通過“下丘腦-垂體-性腺軸(卵巢)”所分泌的激素相互調(diào)節(jié)的結(jié)果。一方面,F(xiàn)SH和LH作為蛋雞卵泡發(fā)育的主要調(diào)控激素,對促進卵泡生長發(fā)育和成熟起關(guān)鍵作用,并同時促進卵巢分泌E2等性激素;另一方面,蛋雞卵巢分泌的E2等性激素與孕激素(P)協(xié)同作用,發(fā)動下丘腦和垂體引起LH釋放從而引起排卵[16]。隨著生產(chǎn)周期延長,蛋雞體內(nèi)生殖激素水平的降低是其產(chǎn)蛋性能下降的主要因素之一。楊文斌等[17]研究發(fā)現(xiàn),補腎中草藥可提高大鼠主動脈、垂體和下丘腦雌激素受體的α、β基因的表達(dá),證明了補腎中藥對提高雌激素受體-配體的結(jié)合力有改善作用。體外細(xì)胞試驗表明,補肝腎中藥能夠提高體外受精胚胎卵泡液轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)和性激素水平[18]。此外,部分補益肝腎中藥具有雌激素樣作用,對性腺軸具有雙向調(diào)節(jié)的功能,使沖任胞脈通暢,有利于卵子發(fā)育和排出。李炳奇等[19]研究表明,中草藥中具有雌激素樣作用的黃酮類能夠明顯增加大鼠卵巢、子宮質(zhì)量,原因是黃酮類促進了卵巢中各級卵泡總數(shù)和子宮內(nèi)膜厚度。這一作用對提高蛋雞產(chǎn)蛋性能和改善蛋品質(zhì)均具有正向效果。本試驗中,4個補益肝腎中藥添加劑復(fù)方均不同程度提高了蛋雞FSH、LH和E2水平,這可能是上述補益肝腎中藥添加劑提高產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)的重要原因之一。
在蛋雞飼糧中添加1%補肝益腎中草藥添加劑,能夠增強蛋雞肝臟和腎臟抗氧化能力,促進生殖激素分泌,提高蛋雞的產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)。綜合效果來看,以白芍、淫羊藿、菟絲子和杜仲等組成的復(fù)方2最好。