假 提取物對(duì)斷奶仔豬回腸黏膜組織形態(tài)及通透性的影響

王定發(fā)，周璐麗，胡海超，周漢林

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南儋州 571737）

小腸是動(dòng)物消化和吸收養(yǎng)分的重要場所，同時(shí)也是動(dòng)物機(jī)體的免疫器官。腸黏膜屏障由腸黏膜表面的粘液層、腸上皮及其緊密連接、上皮基底膜、黏膜下固有層等組成，其中緊密連接對(duì)維持腸黏膜上皮屏障功能有重要作用[1]。仔豬斷奶應(yīng)激可引起食欲差、消化功能紊亂、生長遲緩、飼料利用率低等，進(jìn)而導(dǎo)致腸黏膜細(xì)胞因子分泌改變，腸絨毛高度降低、上皮絨毛變短、隱窩變深等形態(tài)學(xué)變化，并增加腸道黏膜通透性，造成腸道消化吸收功能下降，致使腹瀉率顯著提高[2-3]。應(yīng)用抗生素、化學(xué)藥物作為飼料添加劑是長期以來提高斷奶仔豬生長性能和抗腹瀉的有效手段[4]，但在實(shí)際使用過程中產(chǎn)生的耐藥性及藥物殘留等問題引起人們廣泛關(guān)注。為此，中外研究人員開展了大量有益的嘗試和研究[5-7]，尋求和開發(fā)植物提取物作為新型飼料添加劑來減少或替代飼料中抗生素的使用。

1 材料與方法

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將80頭21日齡斷奶的杜×長×大三元雜交仔豬，隨機(jī)分為4組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭豬。4組分別為在基礎(chǔ)日糧中添加0（T0組）、50（T50組）、100（T100組）和200（T200組） mg/kg假提取物粉劑。參考美國NRC（2012）5～10 kg生長豬營養(yǎng)需要配制基礎(chǔ)日糧，其組成及營養(yǎng)成分見表1。整個(gè)試驗(yàn)期為28 d，自由采食，自由飲水。

1.2.2 樣品采集及測定 在試驗(yàn)的第1和29天清晨對(duì)仔豬進(jìn)行空腹稱重，以重復(fù)為單位記錄仔豬每天的采食量，計(jì)算平均日采食量、平均日增重和耗料增重比（日采食量/日增重）。分別在試驗(yàn)開始第15天和第29天清晨，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1頭仔豬，前腔靜脈采集血液，37 靜置2 h， 3500 r/min離心10 min得到離心分離血清，采用試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定血清中D-乳酸（D-LA）、內(nèi)毒素（ET-1）以及二胺氧化酶（DAO）濃度，方法參照試劑盒說明書。

于試驗(yàn)期第29天清晨，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1頭豬進(jìn)行屠宰，取回腸組織，以4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，H.E.染色，光鏡觀察并記錄組織學(xué)變化。

取回腸黏膜，液氮速凍，于-80 保存。利用RNA提取試劑盒（賽默飛世爾科技（中國）有限公司，上海）提取回腸黏膜總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（百泰克生物技術(shù)有限公司，北京）反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參照，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)回腸黏膜相關(guān)的緊密連接蛋白[咬合蛋白（Occludin）、閉合小環(huán)蛋白-1（ZO-1）、封閉蛋白-1（Claudin-1）]和鈉氫離子交換蛋白-3（NHE-3）進(jìn)行定量分析。相關(guān)引物由上海生工合成，序列見表2。1.3 統(tǒng)計(jì)分析 利用Excel 2010整理數(shù)據(jù)后，采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），并用Tukey's法對(duì)各組平均值進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.3 斷奶仔豬回腸形態(tài)結(jié)構(gòu) 由圖1可見，與對(duì)照組相比，日糧添加50～200 mg/kg的假提取物后，仔豬回腸黏膜絨毛寬度和高度均有所改善。

2.4 仔豬回腸黏膜緊密連接蛋白和NHE-3的mRNA表達(dá) 由表5可知，日糧中添加假提取物組仔豬回腸黏膜中Occludin的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），100、200 mg/kg 組Claudin-1的mRNA表達(dá)顯著高于其他2個(gè)組（P＜0.05），100 mg/kg 組 NHE-3顯著高于其他3個(gè)組（P＜0.05）；而ZO-1的mRNA表達(dá)無顯著變化（P＞0.05）。

表2 RT-PCR所用引物

表3 假提取物對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響

表3 假提取物對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響

注：同行數(shù)字肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05），相同小寫字母或無字母表示差異不顯著（P＞0.05）。下表同

項(xiàng)目 T0 T50 T100 T200初始體重 ,kg 6.39±0.01 6.43±0.03 6.43±0.05 6.47±0.06結(jié)束體重 ,kg 12.84±0.86ab 13.89±0.08a 12.85±0.34ab 12.24±0.31b平均日增重 ,g 222.56±19.74b 257.39±3.65a 221.52±10.03b 198.99±8.48b平均日采食量 ,g 373.55±1.75c 421.95±4.63a 387.64±5.63b 331.20±6.43d耗料增重比 1.70±0.04 1.64±0.04 1.75±0.10 1.67±0.10

表4 假 提取物對(duì)斷奶仔豬血清DAO、D-LA和ET-1濃度影響

表4 假 提取物對(duì)斷奶仔豬血清DAO、D-LA和ET-1濃度影響

項(xiàng)目 T0 T50 T100 T200第15天DAO, ng/mL 9.29±0.30a 8.84±0.15a 6.44±0.31b 6.34±0.22b D-LA, μg/L 1695.00±87.50a 1595.00±112.50a 1257.33±100.00b 895.00±112.50c ET-1, ng/L 417.41±3.88a 393.70±11.21b 171.29±3.28b 131.63±0.63c第29天DAO, ng/mL 7.80±0.30a 6.99±0.15b 6.71±0.23bc 6.14±0.25c D-LA, μg/L 1457.50±175.00a 1182.50±150.00a 807.50±125.00b 557.50±75.00b ET-1, ng/L 285.52±21.30a 221.48±20.78b 200.17±12.50b 216.08±21.55b

表5 斷奶仔豬回腸黏膜緊密連接蛋白和NHE-3的mRNA表達(dá)

3 討 論

圖1 斷奶仔豬回腸形態(tài)結(jié)構(gòu)（H.E.，100×）

在日糧中添加植物源飼料添加劑可緩解仔豬斷奶應(yīng)激導(dǎo)致的仔豬生長性能下降及腹瀉。本試驗(yàn)中，日糧添加50 mg/kg假提取物顯著增加了斷奶仔豬的平均日采食量和日增重，降低了耗料增重比。這可能與假提取物具有抗膽堿酯酶[12]和抗菌消炎[8-9]等活性有關(guān)?？鼓憠A酯酶可使胃腸道平滑肌興奮，促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)并增加胃酸分泌，從而提高動(dòng)物胃腸道對(duì)飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收能力，而且提取物的抗菌消炎活性有助于腸道微生物菌群的調(diào)節(jié)，抑制有害病菌與機(jī)體競爭營養(yǎng)物質(zhì)。屬胡椒科植物，具有辛辣氣味，日糧中添加100～200 mg/kg 假立草 句 提取物可能影響到飼糧的適口性，進(jìn)而降低仔豬日均采食量。

腸道是斷奶應(yīng)激的主要損傷部位之一，斷奶應(yīng)激會(huì)改變仔豬腸道形態(tài)，損傷腸黏膜，從而使胃腸道對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收能力減弱。在本試驗(yàn)中，日糧中添加提取物可以改善和修復(fù)斷奶仔豬回腸黏膜損傷。假提取物含有總酚、黃酮類、不飽和烯類等活性成分[13]，具有較強(qiáng)的抗氧化和抗炎活性[8-9]，有助于改善和修復(fù)斷奶仔豬腸道損傷。

斷奶應(yīng)激會(huì)損傷仔豬腸道黏膜屏障，增大腸道黏膜通透性，破壞腸道對(duì)水分及養(yǎng)分的正常吸收功能，從而導(dǎo)致腹瀉[14]。血清中D-LA、ET-1和DAO濃度變化可以作為反映腸道通透性的指標(biāo)[15]。DAO是存在于腸黏膜絨毛中的細(xì)胞內(nèi)酶，D-LA和ET-1是腸道內(nèi)細(xì)菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物，在正常情況下，三者都主要存在于腸道內(nèi)。當(dāng)腸黏膜受損導(dǎo)致通透性增加時(shí)，腸道內(nèi)的D-LA、ET-1和DAO會(huì)通過受損黏膜滲透進(jìn)入血液。本試驗(yàn)中，前期仔豬血清中D-LA、ET-1和DAO濃度高于后期，說明斷奶應(yīng)激對(duì)腸道通透性具有極大的影響，損傷了腸道黏膜結(jié)構(gòu)，破壞了腸道菌群和絨毛組織，使得腸內(nèi)D-LA、ET-1和DAO滲透入血。日糧中添加提取物使仔豬血清中D-LA、ET-1和DAO濃度顯著下降，說明提取物中活性成分有助于修復(fù)仔豬腸道損傷，改善腸道通透性。緊密連接蛋白是腸道通透性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，Occludin、ZO-1和Claudin-1常被作為腸道組織緊密連接屏障和通透性功能的指標(biāo)[16]。仔豬斷奶前后緊密連接蛋白mRNA高表達(dá)對(duì)仔豬抗腹瀉具有重要意義[17]。NHE-3廣泛存在于哺乳動(dòng)物腸道黏膜上皮細(xì)胞，對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，特別是電解質(zhì)平衡起著重要的調(diào)控作用。在腸道黏膜損傷發(fā)生炎癥時(shí)，小腸液體過度分泌、離子通道的通透性增加，NHE-3表達(dá)水平下降，易導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞內(nèi)水、電解質(zhì)失衡而產(chǎn)生水樣腹瀉。在應(yīng)激情況下，細(xì)菌和內(nèi)毒素通過調(diào)節(jié)或影響一些細(xì)胞因子及蛋白激酶等來調(diào)控ZO-1和Occludin的表達(dá)，從而降低腸道上皮細(xì)胞的屏障功能。而且有研究表明，上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的基因表達(dá)與腸道細(xì)菌的代謝產(chǎn)物有關(guān)[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加提取物可顯著上調(diào)仔豬腸黏膜中Occludin、Claudin-1和NHE-3的mRNA表達(dá)。前期研究表明，日糧中添加提取物，可顯著降低仔豬腸道黏膜中 TNF-α、ⅠL-1β和 ⅠL-6 mRNA 表達(dá)[10]。提取物的抗菌活性可能影響了腸道內(nèi)細(xì)菌的代謝，日糧中添加假立草 句提取物可能是通過影響腸道內(nèi)細(xì)菌代謝及腸道黏膜中細(xì)胞因子來上調(diào)Occludin、Claudin-1和NHE-3的mRNA表達(dá)，改善腸道形態(tài)，進(jìn)而降低腸道通透性。

4 結(jié) 論