不同廠家豬冷凍精液應(yīng)用效果的比較

周開(kāi)鋒，董勝華，張井清，楊景晁，王燕男，張思聰，唐 輝

（1.山東省畜牧總站，山東濟(jì)南 250022；2.山東華盛江泉農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，山東臨沂 276000；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271018）

豬冷凍精液技術(shù)是指利用干冰（-79 ）、液氮霧等作冷卻源，將精液特殊處理后，在超低溫液氮（-196 ）狀態(tài)下長(zhǎng)期保存，解凍后輸精的過(guò)程[1]。精液冷凍保存是人工授精的一項(xiàng)重大變革，Polge等[2]首次進(jìn)行了豬的凍精試驗(yàn)并成功獲得后代。自此以后，世界各國(guó)對(duì)豬凍精技術(shù)開(kāi)展了大量研究，但早期應(yīng)用效果并不理想，使用豬冷凍精液配種后分娩率僅為40%～70%，窩產(chǎn)仔豬數(shù)僅為7～10頭[1,3-4]。近年來(lái)，豬冷凍精液技術(shù)進(jìn)展迅速，國(guó)內(nèi)外業(yè)界都有商業(yè)化推廣的豬冷凍精液，其受胎率和分娩率稍低于鮮精配種[5-6]。

本研究選擇商業(yè)化推廣使用較多的國(guó)內(nèi)和國(guó)外2家豬冷凍精液，通過(guò)分析其解凍和配種產(chǎn)仔效果，旨在驗(yàn)證國(guó)內(nèi)豬冷凍精液的技術(shù)水平，為我國(guó)本土豬冷凍精液基因庫(kù)的建設(shè)和精液推廣提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)于2017年3—8月在山東華盛江泉農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司原種豬場(chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)期5個(gè)月。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 凍精與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選購(gòu)北京某公司豬冷凍精液145頭份（BJ組），每頭份4支凍精細(xì)管；某國(guó)外公司豬冷凍精液145頭份（GW組），每頭份8支凍精細(xì)管。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇臨沂華盛江泉農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司經(jīng)產(chǎn)大白和長(zhǎng)白母豬各70頭。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器 實(shí)驗(yàn)儀器包括scA780-54fc全自動(dòng)精子質(zhì)量分析系統(tǒng)（法國(guó)卡蘇公司）、恒溫水浴鍋（HH-8型，金壇市杰瑞爾電器有限公司）、磁力攪拌器（85-2型，常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠）、MⅠNⅠTUB長(zhǎng)效稀釋粉（德國(guó)米尼圖公司）、BJ專(zhuān)用稀釋液（北京百均達(dá)科技公司）、解凍杯、剪刀、長(zhǎng)針器械、一次性注射器、液氮罐、一次性深部輸精管等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 從國(guó)內(nèi)（BJ組）和國(guó)外（GW組）2家公司的凍精中分別隨機(jī)選取5支大白豬冷凍精液，解凍后測(cè)定精子活率；從本場(chǎng)每日發(fā)情母豬中選擇3～5胎正常斷奶、體況基本一致的健康大白母豬和長(zhǎng)白母豬，每個(gè)品種的70頭母豬隨機(jī)分給2種來(lái)源凍精組人工授精，統(tǒng)計(jì)繁殖性能指標(biāo)。

1.3.2 解凍流程 按2家公司提供的解凍說(shuō)明書(shū)進(jìn)行凍精的解凍。BJ組凍精細(xì)管每次取出1支后，迅速置于50 解凍杯中，用手輕輕攪動(dòng)細(xì)管，保證受熱均勻，解凍16 s后迅速取出，將管外水分擦拭干凈，用剪刀減去細(xì)管1頭，用長(zhǎng)針器械從凍精管另一端將精液擠出到放置在37 恒溫水浴鍋中的輸精瓶中。待4支凍精細(xì)管的精液全部擠入輸精瓶后，再往輸精瓶中緩慢加入37 恒溫BJ專(zhuān)用稀釋液至40 mL，輕輕搖晃，解凍完成，獲得1頭份40 mL精子總數(shù)8億（2億個(gè)/支凍精細(xì)管×4支= 8億）的輸精用精液。

GW組凍精細(xì)管每次取出1支后，迅速置于38解凍杯中，用手輕輕攪動(dòng)細(xì)管，保證受熱均勻，解凍20 s后迅速取出，將管外水分擦拭干凈，用剪刀減去細(xì)管一頭，用長(zhǎng)針器械從凍精管另一端將精液擠出到放置在26 恒溫水浴鍋中的輸精瓶中。待8支細(xì)管的解凍精液全部擠入輸精瓶后，再往輸精瓶中緩慢加入26恒溫MⅠNⅠTUB稀釋液至60 mL，輕輕搖晃，解凍完成，獲得1頭份60 mL精子總數(shù)40億（5億個(gè)/支凍精細(xì)管×8支= 40億）輸精用精液。

1.3.3 精子活率測(cè)定 用潔凈玻璃棒蘸取1滴精液置于載玻片上，然后輕輕放上蓋玻片（不要有氣泡，蓋玻片不游動(dòng)），通過(guò)scA780-54fc全自動(dòng)精子質(zhì)量分析系統(tǒng)測(cè)定凍精解凍后0 min、5 min、15 min、1 d、2 d、3 d的精子活率。

1.3.4 母豬的人工授精 采用子宮深部輸精技術(shù)進(jìn)行輸精，當(dāng)輸精器外管海綿頭到達(dá)子宮頸并鎖緊后，再將內(nèi)管延長(zhǎng)10～15 cm，以通過(guò)子宮頸到達(dá)子宮體內(nèi)或子宮頸前端接近子宮體的部位進(jìn)行輸精[3]。所有凍精配種均由同一名配種員操作，要求凍精稀釋后15 min內(nèi)完成首次輸精，間隔8 h進(jìn)行第2次輸精。配種后18 d開(kāi)始進(jìn)行返情檢查，28 d利用B超妊娠檢查。返情和妊娠檢查陰性的豬為未孕，妊娠檢查為陽(yáng)性的豬為受孕。妊娠鑒定后統(tǒng)計(jì)配種情期受胎率，母豬分娩后記錄產(chǎn)仔母豬數(shù)、每窩總產(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)、死胎數(shù)、木乃伊數(shù)等繁殖性能指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)用SAS9.2軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，精子活率以?xún)鼍?lèi)型為固定效應(yīng)進(jìn)行單因素方差分析；窩產(chǎn)仔數(shù)、健仔數(shù)以精子來(lái)源、品種為固定效應(yīng)進(jìn)行兩因素的方差分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間均數(shù)用Duncan′s方法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著；情期受胎率和配種分娩率指標(biāo)的顯著性檢驗(yàn)方法采用百分?jǐn)?shù)資料的t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來(lái)源凍精精子活率 根據(jù)豬場(chǎng)生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)要求，經(jīng)過(guò)SCA精子全自動(dòng)分析系統(tǒng)檢測(cè)，配種精液精子活率不得低于48%。從表1可見(jiàn)，2組凍精除了解凍后15 min精子活率無(wú)顯著差別外，其他時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)為BJ組精子活率顯著或極顯著高于GW組（P＜0.05或P＜0.01）。BJ組凍精在保存2 d時(shí)的精子活率仍能達(dá)到配種使用標(biāo)準(zhǔn)，而GW組凍精在保存1 d后就已低于使用標(biāo)準(zhǔn)，不能用于配種。

2.2 不同來(lái)源凍精的配種效果 從表2可見(jiàn)，BJ組情期受胎率比GW組凍精高出8.56個(gè)百分點(diǎn)（P＜0.05），其中BJ組大白豬和長(zhǎng)白豬的情期受胎率分別較GW組高出5.71和11.42個(gè)百分點(diǎn)（P＜0.05）；BJ組配種分娩率比GW組凍精高9.99個(gè)百分點(diǎn)（P＜0.05），其中BJ組大白豬和長(zhǎng)白豬的配種分娩率分別高出GW組8.57和11.42個(gè)百分點(diǎn)（P＜0.05）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可通過(guò)加大實(shí)驗(yàn)樣本含量對(duì)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.3 不同來(lái)源凍精的產(chǎn)仔性能 從表3可見(jiàn)，剔除品種影響，BJ組繁育的窩均總產(chǎn)仔數(shù)比GW組高1.48頭，窩均健仔數(shù)平均高出1.61頭，提高幅度分別達(dá)15%和18%（P＜0.05）；其中，BJ組大白豬繁育的窩均總產(chǎn)仔數(shù)和窩均健仔數(shù)比GW組分別高出1.25頭和1.59頭（P＜0.05）；BJ組長(zhǎng)白豬繁育的窩均總產(chǎn)仔數(shù)和窩均健仔數(shù)比GW組分別高出1.70頭和1.65頭（P＜0.05）。BJ組窩均總產(chǎn)仔數(shù)的穩(wěn)定性?xún)?yōu)于GW組（BJ組的變異系數(shù)?。?。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)中，除了解凍后15 min 2組精子活率無(wú)顯著差別外，其他時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)為BJ組精子活率均顯著或極顯著高于GW組。BJ組凍精解凍保存2 d時(shí)的精子活率仍符合配種使用標(biāo)準(zhǔn)，而GW組凍精在保存1 d后精子活率低于使用標(biāo)準(zhǔn)，不能用于配種。這可能與各自使用的稀釋液有關(guān)，也可能與2種來(lái)源凍精的精子密度不同有關(guān)（BJ組凍精解凍稀釋后的精子總數(shù)僅為GW組的1/5）。

本實(shí)驗(yàn)中，BJ組和GW組冷凍精液情期受胎率分別達(dá)87.14%、78.57%，窩均總產(chǎn)仔數(shù)分別為11.30、9.82頭，窩均健仔數(shù)分別為10.70、9.09頭，此3項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到或接近常溫精液的繁育標(biāo)準(zhǔn)，與李兆華[4]、劉瑩[7]報(bào)道結(jié)果近似，明顯高于陳映等[8]的報(bào)道。凍精良好的繁育效果與近年來(lái)國(guó)內(nèi)外豬冷凍精液制作工藝、解凍流程、稀釋液的改進(jìn)等技術(shù)的成熟有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)條件下，BJ組在情期受胎率上有高于GW組的趨勢(shì)，在產(chǎn)仔性能上顯著優(yōu)于GW組，說(shuō)明國(guó)內(nèi)凍精技術(shù)近年來(lái)取得較大進(jìn)步。

表1 不同來(lái)源凍精解凍后精子活率 %

表2 不同來(lái)源凍精的后配種效果

表3 不同來(lái)源凍精的產(chǎn)仔性能

現(xiàn)有產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)下，BJ組豬冷凍精液一次輸精劑量、輸精總精子數(shù)僅為GW組的67%和20%，相比之下BJ組凍精在利用效率上更有優(yōu)勢(shì)，但其相同輸精量和精子數(shù)的配種效果有待進(jìn)一步驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果除了主要受凍精質(zhì)量（冷凍保存技術(shù)）影響外，還會(huì)受到公豬品種、配種時(shí)機(jī)、配種方法、輸精操作人員、飼養(yǎng)管理等因素的影響[9-11]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)上述干擾因素進(jìn)行了控制，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)條件下，BJ組豬冷凍精液在凍精解凍后的精子活率和窩均總產(chǎn)仔數(shù)、窩均健仔數(shù)等指標(biāo)上均優(yōu)于GW組，利用冷凍精液技術(shù)達(dá)到或接近了大群生產(chǎn)常溫精液配種繁育效果，表明國(guó)內(nèi)豬凍精技術(shù)進(jìn)步顯著、優(yōu)勢(shì)明顯，能為我國(guó)利用此技術(shù)體系建立本土種豬冷凍精液基因庫(kù)，以及豬冷凍精液的推廣應(yīng)用提供技術(shù)支持。