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    綿羊ADPN基因和PTGS2基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)性研究

    2018-11-24 03:16:26李婷婷邢亞楠董煥聲潘慶杰
    中國(guó)畜牧雜志 2018年11期
    關(guān)鍵詞:產(chǎn)羔湖羊瓊脂糖

    李婷婷,李 楨,杜 淼,邢亞楠,董煥聲,潘慶杰

    (青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山東青島 2661091)

    綿羊是第1個(gè)被馴化的放牧動(dòng)物,可以給人們提供肉、皮、奶、毛等主要生產(chǎn)和生活材料,發(fā)展綿羊產(chǎn)業(yè)能夠有效提高畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)效益[1]。除少部分綿羊品種常年發(fā)情外,大多數(shù)品種為季節(jié)性發(fā)情,不能全年進(jìn)行配種,這在一定程度上影響了羊的繁殖效率,因此提升綿羊單產(chǎn)能力對(duì)生產(chǎn)效率有至關(guān)重要的影響[2]。由于綿羊高繁殖力的遺傳力較低,致使其育種進(jìn)程非常緩慢[3-4]。湖羊是我國(guó)選育出的高繁殖力綿羊品種之一。湖羊源于北方的蒙古羊[5-6],具有性成熟早、繁殖率高、繁殖周期短、早期生長(zhǎng)快等優(yōu)點(diǎn),母羊的平均產(chǎn)羔率可達(dá)到256%,有的甚至可達(dá)300%以上,是世界上較稀少的具有高繁殖力的綿羊品種之一。相比湖羊而言,杜泊羊的繁殖力比較低,但杜泊羊胴體肉質(zhì)好,生長(zhǎng)發(fā)育速度較快,體重在100日齡時(shí)可以達(dá)到30~35 kg。在繁殖力方面,初產(chǎn)的杜泊母羊和經(jīng)產(chǎn)的杜泊母羊繁殖率分別為135.13%和144.44%[7]。研究表明,ADPN(脂聯(lián)素)基因及PTGS2(前列腺內(nèi)過氧化物合酶2)基因是影響繁殖性狀的2個(gè)主要候選基因[8-9]。本實(shí)驗(yàn)以湖羊和杜泊羊?yàn)檠芯繉?duì)象,采用直接測(cè)序法對(duì)ADPN基因和PTGS2基因進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè),深入分析基因突變與繁殖力的關(guān)系,為進(jìn)一步完善基因選育在綿羊生產(chǎn)中的應(yīng)用、提高羊繁殖能力提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及采樣方法 實(shí)驗(yàn)選擇有1~3胎的產(chǎn)羔記錄、身體健康的65只湖羊和60只杜泊羊,在山東省朝陽畜牧有限公司同一飼喂條件下自由采食和飲水。在每只羊的耳緣部用75%酒精棉球消毒后,用耳標(biāo)鉗取耳組織1~2 cm,置于盛有無水乙醇的1.5 mL的離心管中,并在每個(gè)離心管上標(biāo)上耳號(hào),放入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室,-80 保存。

    1.2 主要耗材、試劑 細(xì)胞/血液/組織基因組DNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司提供;DNA Marker、6×Loading Buffer、Premix Taq均購(gòu)自 TaKaRa公司;核酸染料購(gòu)自上海生工生物工程公司;無水乙醇,50×TAE緩沖液,瓊脂糖。

    1.3 基因組DNA的提取 采用細(xì)胞/血液/組織基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行湖羊和杜泊羊的耳組織基因組DNA的提取。

    1.4 基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳 利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的純度,核酸分析儀測(cè)定DNA濃度,DNA OD260/OD280均在1.7~1.9。

    1.5 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增與檢測(cè) 以牛ADPN基因序列為參照[10],使用Primmer5.0設(shè)計(jì)ADPN基因引物,擴(kuò)增ADPN基因第3外顯子部分序列;根據(jù)Gladney等[11]提供的牛第3外顯子到第5外顯子的引物作為羊的PTGS2基因引物。引物均由上海生工生物工程公司合成,引物序列見表1。

    1.6 PCR擴(kuò)增體系的建立 PCR擴(kuò)增體系25 μL:上、下游引物各 1 μL;DNA 模板 1 μL;Premix Taq酶 12.5 μL;超純水 9.5 μL。ADPN基因引物的最佳PCR反應(yīng)程序:95 預(yù)變性3 min,95 變性30 s,55 退火30 s,72 延伸1 min,35個(gè)循環(huán),72 延伸10 min,4 保存。PTGS2基因引物的最佳PCR反應(yīng)程序:95 預(yù)變性3 min,95 變性30 s,53 退火30 s,72 延伸1 min,35個(gè)循環(huán),72 延伸10 min,4保存。產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

    1.7 PCR產(chǎn)物的切膠回收 使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收純化,DNA溶液直接送去測(cè)序。

    對(duì)ADPN、PTGS2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增切膠直接測(cè)序,對(duì)測(cè)得的序列用Megalign軟件進(jìn)行序列比對(duì),并用Blast軟件與NCBⅠ上的原始序列進(jìn)行比對(duì)。

    1.8 統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用Excel 2010 軟件統(tǒng)計(jì)各綿羊ADPN、PTGS2基因位點(diǎn)的突變數(shù)、基因型及產(chǎn)羔數(shù),數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。用SPSS 22.0 軟件中一般線性模型完成湖羊、杜泊羊基因型與產(chǎn)羔表型數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 基因組DNA提取結(jié)果 從圖1中可以看到,條帶清晰,亮度較高,無拖尾現(xiàn)象,說明基因組DNA純度比較好,提取過程沒有蛋白質(zhì)污染,沒有DNA降解,所提取的DNA符合后續(xù)的PCR擴(kuò)增要求。

    圖1 湖羊和杜泊羊DNA檢測(cè)結(jié)果

    2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 如圖2顯示,湖羊和杜泊羊ADPN基因引物和PTGS2基因引物PCR產(chǎn)物的目的條帶明亮并且整齊一致,擴(kuò)增片段的大小正確,特異性較好,可以用來進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。ADPN、PTGS2基因的目的片段分別是659、1 600 bp。

    2.3 基因純化 除去PCR產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)及其他有機(jī)化合物、無機(jī)鹽離子、寡核苷酸引物等雜質(zhì),提純后的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),可以用來直接測(cè)序(圖3)。

    2.4 突變位點(diǎn)的檢測(cè)

    2.4.1ADPN基因堿基突變的檢測(cè) 如圖4~7所示(為保證突變清洗,截取部分序列長(zhǎng)度),ADPN基因在133 bp處發(fā)生G→A的突變,該位點(diǎn)的密碼子由GAT轉(zhuǎn)變成AAT,并使編碼的氨基酸由D(天冬氨酸)轉(zhuǎn)變成N(天冬酰胺);在594 bp處也發(fā)生G→A的突變,該位點(diǎn)的密碼子由AGA轉(zhuǎn)變?yōu)锳AA,編碼的氨基酸由R(精氨酸)轉(zhuǎn)變?yōu)镵(賴氨酸)。

    表1 引物序列

    圖2 ADPN、PTGS2基因PCR檢測(cè)結(jié)果

    圖3 ADPN 、PTGS2基因純化結(jié)果

    圖4 ADPN基因在133 bp處的堿基突變

    圖5 ADPN基因133bp處的峰圖

    圖6 ADPN基因在594 bp處的堿基突變

    圖7 ADPN基因594 bp處的峰圖

    2.4.2PTGS2基因堿基突變的檢測(cè) 如圖8、9所示,PTGS2基因在77 bp處發(fā)生遺傳變異,該位點(diǎn)的密碼子由AAA轉(zhuǎn)變?yōu)镃AA,并使編碼的氨基酸由K(賴氨酸)轉(zhuǎn)變?yōu)镼(谷氨酰胺)。

    圖8 PTGS2基因在77 bp的堿基突變

    圖9 PTGS2基因77 bp處的峰圖

    2.5 基因突變對(duì)產(chǎn)羔數(shù)的影響 湖羊1年產(chǎn)羔羊2次或者2年產(chǎn)羔羊3次,母羊平均的產(chǎn)羔率可達(dá)256%;與湖羊相比,杜泊羊的平均產(chǎn)羔率為140%。如表2顯示,湖羊ADPN、PTGS2基因突變數(shù)均極顯著高于杜泊羊(P<0.01);湖羊平均產(chǎn)羔數(shù)極顯著高于杜泊羊(P<0.01)。

    表2 基因突變對(duì)產(chǎn)羔數(shù)的影響

    2.6 相關(guān)性分析 由表3可以看出,ADPN基因和PTGS2基因的突變與產(chǎn)羔數(shù)呈現(xiàn)極顯著相關(guān)(P<0.01),說明相關(guān)系數(shù)的值不是偶然因素造成的;而ADPN基因和PTGS2基因Pearson相關(guān)系數(shù)值都大于0,說明這2個(gè)基因的突變與產(chǎn)羔數(shù)之間存在高度的線性正相關(guān)。

    表3 ADPN、PTGS2基因與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性(n=125)

    3 討 論

    ADPN基因在生殖過程中通過不同水平表達(dá)來調(diào)控下丘腦和垂體、卵巢或者直接作用卵母細(xì)胞和胚胎以及雄性睪丸等。劉重旭等[12]在研究中國(guó)西南9個(gè)山羊品種發(fā)現(xiàn),3′UTR區(qū)發(fā)生G→A突變,在不同的山羊品種中等位基因的頻率不相同。本研究在ADPN基因外顯子3共檢測(cè)到2個(gè)突變。楊彥杰等[13]對(duì)于牛的研究顯示,ADPN基因外顯子上檢測(cè)到1個(gè)突變位點(diǎn),由于牛、羊在生物分類學(xué)上歸入偶蹄目??疲鶠榉雌c類食草動(dòng)物,由此說明牛和羊在進(jìn)化進(jìn)程中雖然共祖,但又產(chǎn)生了基因遺傳的差異性。本研究在內(nèi)含子上沒有發(fā)現(xiàn)堿基突變,這與曹海洋[10]在小尾寒羊上檢測(cè)到內(nèi)含子中4個(gè)突變不相符,可能是綿羊品種間存在個(gè)體差異性。

    Liu等[14]和Sirois[15]研究發(fā)現(xiàn),PTGS2的表達(dá)調(diào)控決定著反芻類食草動(dòng)物排卵進(jìn)程的長(zhǎng)短。研究發(fā)現(xiàn),PTGS2基因缺陷型的小鼠卵泡正常發(fā)育,但因黃體缺乏而導(dǎo)致不能正常排卵[16]。Linville等[17]發(fā)現(xiàn),將野生型胚泡植入到PTGS2缺陷型小鼠子宮內(nèi),往往不能發(fā)育,進(jìn)一步證實(shí)了PTGS2基因?qū)ν懩さ闹匾?。本?shí)驗(yàn)在湖羊的堿基序列上檢測(cè)到1處突變位點(diǎn),這與梁瑞圓等[18]發(fā)現(xiàn)小尾寒羊上PTGS2基因擴(kuò)增片段中均存在堿基突變的結(jié)果一致。

    與杜泊羊相比,湖羊高繁殖力的特征較為顯著。在本研究中,高繁殖力的湖羊群體在ADPN基因和PTGS2基因都有突變位點(diǎn),而在杜泊羊群體中沒有發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。湖羊在ADPN基因133 bp處發(fā)生G→A突變,并使編碼的氨基酸由D(天冬氨酸)轉(zhuǎn)變成N(天冬酰胺);在594 bp處也發(fā)生了G→A突變,編碼的氨基酸由R(精氨酸)轉(zhuǎn)變?yōu)镵(賴氨酸)。在PTGS2基因77 bp處發(fā)生了A→C突變,并使編碼的氨基酸由K(賴氨酸)轉(zhuǎn)變?yōu)镼(谷氨酰胺)。同時(shí),通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),基因的突變率與產(chǎn)羔數(shù)呈顯著相關(guān),研究結(jié)果證明ADPN基因與PTGS2基因參與調(diào)控綿羊的繁殖效率。

    4 結(jié) 論

    本研究發(fā)現(xiàn),ADPN基因與PTGS2基因突變與產(chǎn)羔數(shù)呈顯著相關(guān),進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)基因是影響湖羊高繁殖力的基因,可以作為高繁多胎性狀的候選基因。

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