miRNAs 對睪丸內(nèi)細(xì)胞功能調(diào)控的研究進(jìn)展

高月鋒，楊宇澤，簡路洋，蘆 偉，曲揚(yáng)華，羅海玲*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.北京市畜牧總站，北京 100101）

睪丸內(nèi)細(xì)胞類型眾多，可以分為生殖細(xì)胞和體細(xì)胞兩大類。生殖細(xì)胞依照動(dòng)物的發(fā)育階段分為精原干細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞和成熟精子。體細(xì)胞分為間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞、淋巴內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞[1]。近幾年，雄性繁殖相關(guān)的研究從針對睪丸質(zhì)量以及組織形態(tài)學(xué)的研究轉(zhuǎn)移到細(xì)胞水平。

miRNAs是一類約為22 nt的短鏈非編碼RNA[2]。編碼miRNAs的基因通常位于基因間、外顯子或內(nèi)含子區(qū)域[3]，miRNAs可與Argonaute（AGO）蛋白結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RⅠSC），RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物中的miRNA的種子序列（大約2～7 nt）可與靶基因mRNA 3' UTR區(qū)域不完全互補(bǔ)配對，或通過降低靶基因mRNA，抑制其翻譯。部分研究表明，miRNAs可直接作用于靶基因序列，影響基因表達(dá)。同一個(gè)miRNA可以調(diào)控不同的靶基因，多個(gè)miRNAs也可以同時(shí)調(diào)控同一個(gè)靶基因[4]。miRNAs對睪丸的精子發(fā)生[5]及間質(zhì)細(xì)胞[6]、支持細(xì)胞[7]和生殖細(xì)胞[8]的功能都起到重要的調(diào)控作用。本文綜述了近年來miRNAs對睪丸內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞以及生殖細(xì)胞功能調(diào)控的研究進(jìn)展，以期為本領(lǐng)域的研究者提供參考。

1 間質(zhì)細(xì)胞

間質(zhì)細(xì)胞位于睪丸的間質(zhì)空間，主要作用是分泌類固醇激素睪酮。睪酮分泌主要受促黃體素（LH）調(diào)控。睪酮作用于支持細(xì)胞的雄激素受體[9]，從而影響支持細(xì)胞的功能。當(dāng)睪酮分泌終止，會造成生殖細(xì)胞從支持細(xì)胞分離，最終導(dǎo)致生殖細(xì)胞死亡[10]。部分研究表明，miRNAs與間質(zhì)細(xì)胞有直接或者間接的聯(lián)系。miRNA-125a和miRNA-455可以靶向受體SRBⅠ，降低類固醇激素的生成[11]。成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）可以顯著下調(diào)和上調(diào)早期間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)miR-142-3p和miR-335的表達(dá)[12]。敲除miRNAs-140-5p/3p的胚胎，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增加[6]。以上研究表明，miRNAs可能間接影響間質(zhì)細(xì)胞的功能。

但miRNAs與間質(zhì)細(xì)胞功能的直接研究卻少有報(bào)道。類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白（STAR）可將類固醇由線粒體外膜轉(zhuǎn)移至內(nèi)膜，此過程是類固醇激素合成的限速步驟。miRNA-150通過抑制STAR在mRNA及蛋白水平的表達(dá)，降低睪酮及其前體物的合成，最終影響精子的發(fā)生[13]。綜合以上研究結(jié)果，miRNAs也許可以調(diào)控間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量以及能夠調(diào)控睪酮的分泌。miRNAs對間質(zhì)細(xì)胞更多的調(diào)控作用還有待進(jìn)一步挖掘。

2 支持細(xì)胞

2.1 支持細(xì)胞Dicer特異性敲除 支持細(xì)胞為精子的成熟提供支持、營養(yǎng)和保護(hù)作用。眾多研究結(jié)果表明，特異性敲除支持細(xì)胞內(nèi)miRNAs合成關(guān)鍵酶Dicer，發(fā)現(xiàn)miRNAs與支持細(xì)胞的功能及精子發(fā)生有密切關(guān)系。Papaioannou 等[14]發(fā)現(xiàn)，小鼠支持細(xì)胞Dicer缺失造成睪丸退化和精子缺失，最終造成不育。Kim等[15]通過雜交獲得了支持細(xì)胞Dicer特異性缺失的小鼠，胚胎期胚胎發(fā)育正常；在產(chǎn)后第0天，曲細(xì)精管的數(shù)量和形態(tài)并未表現(xiàn)出異常，但與睪丸發(fā)育、精子發(fā)生及結(jié)構(gòu)完整性相關(guān)的基因表達(dá)皆下調(diào)；在產(chǎn)后第3天表現(xiàn)出大量的凋亡，造成生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞缺失，以及睪丸尺寸降低；在產(chǎn)后第6天，表現(xiàn)出曲細(xì)精管數(shù)量降低及不育的癥狀[15]。Papaioannou等[16]研究結(jié)果表明，支持細(xì)胞Dicer缺失會使得睪丸內(nèi)蛋白表達(dá)譜發(fā)生變化，Cu/Zn -SOD-1上調(diào)，因細(xì)胞凋亡而發(fā)生的細(xì)胞死亡增多。雖然以上試驗(yàn)并未對miRNAs與支持細(xì)胞的直接功能進(jìn)行研究，但Dicer是細(xì)胞合成miRNAs的關(guān)鍵酶之一，Dicer特異性缺失，睪丸發(fā)育以及精子發(fā)生相繼受到不同程度的影響，可以間接說明miRNAs或許對支持細(xì)胞功能行使和精子發(fā)生具有重要的調(diào)控作用。

2.2 支持細(xì)胞增殖和凋亡 生殖細(xì)胞增殖和分化期間需依托于支持細(xì)胞。支持細(xì)胞的數(shù)量可在一定程度上決定生殖細(xì)胞的數(shù)量。多數(shù)物種的支持細(xì)胞的增殖發(fā)生在青春期前[17-19]，但魚類和兩棲類在性成熟后也會發(fā)生增殖[20]。支持細(xì)胞的增殖受多種因素調(diào)控，包括FSH、類固醇激素、雄激素和甲狀腺激素和生長因子（如胰島素樣生長因子）[19,21-22]。

支持細(xì)胞的增殖同樣也受到多種miRNAs的調(diào)控。Zhang等[23]研究表明，17β-雌二醇通過抑制miR-1285表達(dá)，從而激活A(yù)MPK來降低支持細(xì)胞的增殖。磷酸化的AMPK可通過增加p53和p27表達(dá)以及抑制mTOR和Skp2表達(dá)參與調(diào)節(jié)17β-雌二醇介導(dǎo)的支持細(xì)胞活力的抑制。此外，miR-133b可以靶向GLⅠ3，下調(diào)其表達(dá)，并促進(jìn)支持細(xì)胞的增殖[7]。miR-762可促進(jìn)豬未成熟支持細(xì)胞的增殖并抑制細(xì)胞凋亡，主要通過靶向結(jié)合RNF4的3'UTR區(qū)域，下調(diào)該基因的表達(dá)。RNF4是一種核轉(zhuǎn)錄因子，可作為雄激素受體依賴性轉(zhuǎn)錄中的共激活因子，降低的RNF4表達(dá)削弱了雄激素受體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性[24]。以上研究結(jié)果說明，miRNAs可對支持細(xì)胞的活力、增殖和凋亡起到調(diào)控作用。

3 生殖細(xì)胞

3.1 生殖細(xì)胞Dicer特異性敲除 生殖細(xì)胞是繁殖功能的直接執(zhí)行者，生殖細(xì)胞與miRNAs間的研究日益增多。當(dāng)特異性敲除小鼠原始生殖細(xì)胞和精原細(xì)胞內(nèi)的Dicer，原始生殖細(xì)胞和精原細(xì)胞表現(xiàn)出增殖能力下降[8]。此外，生殖細(xì)胞Dicer1的特異性敲除造成曲細(xì)精管內(nèi)很少出現(xiàn)成熟精子，分化的成熟精子也表現(xiàn)出形態(tài)異常和活力低下，僅少數(shù)缺乏Dicer1的精子能夠和野生型小鼠的卵子結(jié)合，生成后代[25]。

敲除Dicer也會造成睪丸尺寸的降低和精子發(fā)生過程的紊亂，造成附睪內(nèi)成熟精子數(shù)量降低，精子形態(tài)異常，但精原細(xì)胞分化似乎未被影響，敲除后的睪丸中單倍體細(xì)胞的數(shù)量減少，凋亡的精母細(xì)胞數(shù)量增加。在晚期單倍體分化中發(fā)現(xiàn)明顯的缺陷[26]。在雄性生殖細(xì)胞發(fā)育的開端選擇性敲除Dicer1，由于減數(shù)分裂和減數(shù)分裂后期的多重累積性缺陷，導(dǎo)致功能性精子缺乏，表現(xiàn)出不育的癥狀。同時(shí)，精母細(xì)胞到前期Ⅰ過程發(fā)生推遲，凋亡率增加，圓形精子細(xì)胞數(shù)量降低。從圓形到成熟精子的過渡過程也受到嚴(yán)重影響，在突變體中形成的少數(shù)精子不動(dòng)且畸形，表現(xiàn)出精子頭部和鞭毛的形態(tài)缺陷，并且 Sine家族轉(zhuǎn)座因子的表達(dá)在Dicer1缺失的精母細(xì)胞中上調(diào)[27]。綜上所述，生殖細(xì)胞Dicer的特異性敲除可造成睪丸尺寸降低以及生殖細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)和功能的異常，間接說明了miRNAs或許對生殖細(xì)胞功能具有重要的調(diào)控作用。

3.2 生殖細(xì)胞更新及分化 精原干細(xì)胞的自我更新能力是生殖細(xì)胞行使生殖功能的基礎(chǔ)。通過自我更新，精原干細(xì)胞能夠保持?jǐn)?shù)量的穩(wěn)定。精原干細(xì)胞的更新受到間質(zhì)細(xì)胞以及支持細(xì)胞分泌的信號分子的調(diào)控，同時(shí)也受到其自身miRNAs的調(diào)控。研究表明，miR-21、miR-34c、miR-182、miR-183和miR-146a主要在精原干細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[28]。在研究中通過抑制miR-21的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)凋亡的生殖細(xì)胞數(shù)量增多，將供體來源的細(xì)胞移植到受體后，供體來源的細(xì)胞集落數(shù)量顯著降低，并發(fā)現(xiàn)控制生殖干細(xì)胞自我更新的轉(zhuǎn)錄因子ETV5可調(diào)控miR-21的表達(dá)，說明miR-21在精原干細(xì)胞更新及精子發(fā)生過程中的重要作用[28]。He等[29]研究表明，miR-20和miR-106a主要在精原干細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并可通過作用于STAT3和Ccnd1基因調(diào)控精原干細(xì)胞的自我更新。miR-184的表達(dá)限于從精原細(xì)胞到圓形的生殖細(xì)胞精子細(xì)胞。miR-184的過表達(dá)促進(jìn)生殖細(xì)胞系GC-1spg的增殖，它可通過作用于NCOR2的 3' UTR，抑制NCOR2蛋白的表達(dá)。因此，miR-184對精子發(fā)生的調(diào)控或許通過NCOR2基因[30]。Liang等[31]研究表明，miR-34c可以在轉(zhuǎn)錄后水平，抑制ATF1在蛋白水平的表達(dá)，促進(jìn)GC-2生殖細(xì)胞凋亡過程。以上研究結(jié)果進(jìn)一步說明，miRNAs作為重要的調(diào)控因子對生殖細(xì)胞的更新起到調(diào)控作用。

精子發(fā)生需經(jīng)歷由精原細(xì)胞向精母細(xì)胞的過渡階段，此階段同樣受到許多miRNAs的調(diào)控作用。McⅠver等[32]研 究 表 明，miR-293、miR-291a-5p、miR-290-5p、miR-294、miR-136、miR-743a 和 miR-463 在精原細(xì)胞分化成精母細(xì)胞的過程中起到至關(guān)重要的作用，這些miRNAs主要參與PTEN和Wnt信號通路，并發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的細(xì)胞周期調(diào)控因子Cyclin D1也是重要的靶基因之一。Luo等[33]利用高通量測序技術(shù)研究了B型精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中miRNAs的表達(dá)譜，結(jié)果表明2種類型的細(xì)胞中Let-7家族miRNA的表達(dá)水平都非常高。在從精原細(xì)胞向精母細(xì)胞分化期間，miR-21、miR-140-3p、miR-103、miR-30a、miR-101和 miR-99b的表達(dá)水平降低，這些miRNAs靶向參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞連接形成和細(xì)胞周期調(diào)控的重要基因[33]。

3.3 染色質(zhì)重塑 精子發(fā)生過程中會發(fā)生染色質(zhì)重塑，染色質(zhì)中的組蛋白會演變成過渡蛋白，最終演變成魚精蛋白。最近研究表明，miR-122a可以通過降解miRNA的轉(zhuǎn)錄本，抑制蛋白Tnp2的表達(dá)，Tnp2作為一種過渡蛋白，主要參與精子染色質(zhì)重塑過程，對精子由精原細(xì)胞向成熟精子分化起到重要作用[34]。以上研究說明，miRNAs或許可以調(diào)控精子染色質(zhì)重塑過程。

4 miRNAs對睪丸內(nèi)細(xì)胞功能調(diào)控

睪丸內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞作為睪丸內(nèi)行使繁殖功能的主要細(xì)胞類群，完成各自功能的同時(shí)受到自身多種miRNAs的調(diào)控。睪丸各細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的miRNA、下游靶基因及行使的功能總結(jié)見表1。

5 結(jié) 論

miRNAs可以影響間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量及睪酮合成、調(diào)控支持細(xì)胞的增殖和凋亡以及生殖細(xì)胞的細(xì)胞周期、凋亡和染色質(zhì)重塑，最終影響精子的發(fā)生過程。但有關(guān)miRNAs作用于睪丸細(xì)胞內(nèi)的許多研究結(jié)果都局限于候選miRNAs及下游靶基因的識別，后續(xù)需要研究miRNAs在各細(xì)胞信號通路中起到的作用，更詳盡地揭示miRNAs對睪丸細(xì)胞的作用機(jī)制。

表1 睪丸各細(xì)胞內(nèi)miRNAs的表達(dá)及功能