雙盲口線蟲ITS rDNA的PCR擴增及序列分析

劉夢婷，李 芬，靳元春，孫淼淼，劉國華,

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，長沙 410128；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730046）

雙盲口線蟲（Contracaecum osculatum）是屬于異尖科、對盲囊屬的一種海魚線蟲，主要寄生于魚類和海洋哺乳動物，并可傳播到人類，引起與幼蟲感染或過敏反應有關的胃腸疾病癥狀[1]。雙盲口線蟲病是一種海洋自然疫源性疾病[2]。異尖線蟲的幼蟲可經(jīng)口感染寄生于人體消化道各部位，亦可引起內(nèi)臟幼蟲移行癥，從而使人出現(xiàn)胃腸不適，嚴重者會突發(fā)劇痛伴惡心、腹瀉、嘔吐等癥狀，與外科急腹癥極為相似[3-4]。研究表明，雙盲口線蟲三級幼蟲具有穿透組織及胃粘膜，引起出血和嗜酸性肉芽腫反應的能力，最重要的是雙盲口線蟲也具有人畜共患的潛質(zhì)[5]。因此，迅速而準確的鑒別雙盲口線蟲具有重要的社會公共衛(wèi)生意義。

傳統(tǒng)寄生蟲的分類依據(jù)主要包括宿主、傳播方式、病原的形態(tài)學、致病性、生活史等。由于傳統(tǒng)分類方法具有很大主觀性，在一些種的鑒定上存在一些爭論，尤其在病原形態(tài)接近或相似的情況下，用傳統(tǒng)分類學對病原進行分類會遇到難以解決的問題[6]。因此，利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，直接在遺傳物質(zhì)DNA的核苷酸組成上檢測遺傳變異成為區(qū)分個體間遺傳差異最有效的方法之一。核糖體DNA（rDNA）的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacers，ITS）中包含的ITS-1及ITS-2序列在生物進化過程中一般顯示種的特征，種內(nèi)具有高度保守性，而在不同種間又有不同程度的變異，是比較理想的種間鑒定的遺傳標記，被廣泛應用于物種的分類鑒定中[7-8]。

本研究以從波蘭大西洋鱈采集到的8條雙盲口線蟲為研究對象，PCR擴增獲得其ITS rDNA序列并進行比較和分析，探索雙盲口線蟲的ITS rDNA序列能否成為理想的種間遺傳標記，從而為雙盲口線蟲的分類鑒定、分子流行病學調(diào)查以及寄生蟲病的防治等提供科學依據(jù)[9-10]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體樣本 采自波蘭大西洋鱈體內(nèi)，樣品代碼為COSC1、COSC2、COSC3、COSC4、COSC5、COSC6、COSC7及COSC8，保存于75%酒精中備用。

1.1.2 主要試劑和儀器 DNA提取試劑盒WizardTMDNA Clean Up System為Promega公司產(chǎn)品；蛋白酶K為Mereck公司產(chǎn)品；rTaq酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、DNA Marker DL2000、IPTG和X-gal均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；凝膠成像分析儀為英國UVItec公司產(chǎn)品；Biometra PCR儀為德國Biometra公司產(chǎn)品；Bio-RAD電泳儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒為上海華舜生物工程公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 蟲體DNA提取 從-20℃的酒精保存液中取出單個蟲體，置于新鮮滅菌過的1.5 mL離心管中，用蒸餾水反復吹打沖洗3次后，浸泡20 min，吸干表面水分后再反復剪碎。加入275 mL的SDS DNA裂解液（nuclei lysis solution 200 mL、0.5 mol/L EDTA(pH8. 0) 50 mL、4 mg/mL RNase A solution 5 mL、20 mg /mL Proteinase K 20 mL），混勻后，放于微量恒溫器中，55℃反應15～18 h，每隔1～2 h 震蕩1次。消化完全后，根據(jù)Promega 試劑盒的WizardTMDNA Clean-Up System使用說明，提取樣品蟲體的DNA，置于-20℃中保存。

1.2.2 PCR擴增目的片段 由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成ITS-1上游引物NC5：5'-GTAGGTGAAC CTGCGGAAGGATCATT-3'，下游引物NC13R：5'-GCTGCGTTCTTCATCGAT-3'；ITS-2上游引物NC5：5'-ATTGCGCCATCGGGTTCATTCC-3'，下游引物NC2：5'-TTAGTT TCTTTTCCTCCGCT-3'。擴增體系25 μ L：10×buffer 2.5 μL、MgCl2(25 mmol/ L)3.0 μL、上下游引物各0.25 μL、rTaq 酶0.25 μL、DNA 樣品1 μL，無菌ddH2O補充至25 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃ 變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃再延伸5 min。同時設置陰性對照組。

1.2.3 擴增片段的克隆和篩選 采用切膠回收的方法對PCR 產(chǎn)物進行純化，將純化后的產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy載體上，然后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞JM109中，在含氨芐青霉素和IPTG的LB平板上無菌挑選白色的單菌落進行培養(yǎng)后，菌液PCR鑒定篩選陽性克隆。

1.2.4 測序與分析 經(jīng)鑒定為陽性的樣品送深圳華大基因公司測序，然后將測序結(jié)果用DNAStar和Clustalx軟件進行序列分析和比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCR擴增結(jié)果PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，8份樣品均成功擴增出大小約為1000 bp的片段，與預期目的片段大小一致（圖1），空白對照為陰性，無非特異性條帶。

圖1 雙盲口線蟲ITS序列的PCR擴增結(jié)果Fig.1 Ampli fication of ITS rDNA from Contracaecum osculatum samples

2.2 DNA測序與序列分析測序后去掉引物，找到ITS-1 rDNA及ITS-2 rDNA序列的頭尾，8份雙盲口線蟲序列（見表1）的ITS rDNA片段大小為885～927 bp，除含有ITS-1 rDNA全序列（441～449 bp）、5.8S rDNA全序列(155 bp) 和ITS-2 rDNA全序列（266 bp）外，還包括18S rDNA和28S rDNA部分序列。判定18S rDNA--ITS-1 rDNA--5.8S rDNA--ITS-2 rDNA-28S rDNA界限系參照GenBank收錄的KM273051.1確定。將測得序列與GenBank上公布的雙盲口線蟲ITS rDNA序列（登錄號：KU306718.1）進行比較，相似度為98%～100%，確定8條樣品屬于雙盲口線蟲。將樣品進行種內(nèi)對比，發(fā)現(xiàn)不同個體間的5.8S rDNA序列無差異，均為155 bp且無差異性，證明5.8S rDNA具有高度保守性；而在ITS-1 rDNA和ITS-2 rDNA的序列中則存在一定差異，分別為0～2.2%和0～3.4%。與其他異尖科線蟲的種間差異分析表明，與ITS-1 rDNA差異高于20%，ITS-2 rDNA差異高于35%。從堿基組成來看，8個樣品ITS序列的A+T 含量（TS-1：53.45%～54.34%；ITS-2：57.14%～58.65%）稍高于G+C 含量（ITS-1：45.66%～46.55%；ITS-2：41.35%～42.86%）。

表1 雙盲口線蟲8份樣品GenBank序列號Table 1 The GenBank serial number of isolated from samples Contracaecum osculatum

對蟲體進行迅速而準確的鑒定分類是寄生蟲研究的前提和基礎。依靠寄生蟲形態(tài)學特征為主要標準的傳統(tǒng)方法在生物種群的不斷進化和發(fā)展中逐漸顯示出局限性，特別是在針對相似種或近緣種的研究中，僅依靠形態(tài)學特征很難完成蟲種鑒定。在現(xiàn)代分子生物學研究的推動下，寄生蟲的分類鑒定也逐漸向分子水平方向發(fā)展[11]。具有功能上的高度保守性和進化的時鐘性特點的rDNA序列，已被越來越多地用于物種分類和遺傳進化關系的研究，尤其是種間分類研究[11-13]。

PCR技術(shù)在寄生蟲學領域的應用也日益廣泛和深入，寄生蟲分子分類學研究的關鍵是選擇合適的靶序列[14]。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS是位于rDNA上的區(qū)域片段，包括ITS-1 rDNA和ITS-2rDNA兩段序列，分別位于18S rDNA-5.8S rDNA和5.8S rDNA-28S rDNA之間。18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA的高度保守性對于PCR擴增非常有利。此外，由于ITS rDNA區(qū)域受外界環(huán)境因素的影響較小，序列的進化速度較其他區(qū)域快，具有高變異性，因而具有種內(nèi)變異小而種間變異大的特性，是種類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析的重要分子標記[15-16]。研究表明ITS rDNA序列是研究寄生蟲分類鑒定及遺傳變異的理想標記[10,17]。目前已有許多應用ITS rDNA序列作為線蟲種鑒別的分子標記的研究報道[17-20]。

本研究對采自波蘭大西洋鱈的雙盲口線蟲ITS-1 rDNA、ITS-2 rDNA進行PCR擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同個體的ITS-1 rDNA和ITS-2 rDNA序列存在很小的種內(nèi)變異，分別為0～2.2%、0～3.4%。將樣品與其他異尖線蟲ITS rDNA序列（表2）相比，差異性分別高于20%（ITS-1 rDNA）和35%（ITS-2 rDNA），遠遠高于其種內(nèi)差異性（2.2%和3.4%），說明ITS rDNA可以作為種間的遺傳變異標記，用于雙盲口線蟲的分子鑒定。

表2 異尖線蟲ITS序列信息Table 2 Representative sequences of ITS sequences of Anisakis spp

本研究結(jié)果僅僅基于有限的樣品數(shù)和單一的基因標記，在進一步的研究中，我們需要收集更多的來自不同地區(qū)的雙盲口線蟲樣品，聯(lián)合多基因標記對其進行更加系統(tǒng)和深入的研究。