豬紅斑丹毒絲菌云南YNKMYZS-2016株的分離鑒定

鄭碧妞，陶 松，巖 銳，王建聶，陳建華，字品文，姚 俊，王生奎

（1. 云南省怒江傈僳族自治州瀘水市農(nóng)業(yè)和科學(xué)技術(shù)局，瀘水673199；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；3. 云南省普洱市孟連傣族拉祜族佤族自治縣農(nóng)業(yè)和科學(xué)技術(shù)局，孟連665800；4. 云南省文山市柳井彝族鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，文山663012；5. 云南省麗江市寧蒗彝族自治縣農(nóng)業(yè)和科學(xué)技術(shù)局，寧蒗673500；6. 云南省大理白族自治州云龍縣果橋鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云龍672708；7. 云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224）

紅斑丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）俗稱(chēng)豬丹毒桿菌，屬于丹毒桿菌屬，形直或微彎，是一種纖細(xì)的小桿菌，在感染動(dòng)物的組織觸片或血片中呈單在、成對(duì)或小叢狀。在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)差，加入少量血液或血清，或在肉肝胃酶消化培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。在固定培養(yǎng)基上培養(yǎng)，可形成光滑（S）型、粗糙（R）型和中間（I）型菌落。紅斑丹毒絲菌不運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)生芽孢，無(wú)夾膜，革蘭氏染色陽(yáng)性[1]。紅斑丹毒絲菌可感染包括哺乳動(dòng)物、禽和魚(yú)類(lèi)等70多種動(dòng)物，其中豬最敏感。紅斑丹毒絲菌主要感染3～12月齡豬，一年四季均可發(fā)病，發(fā)病率一般為10%～15%，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50%[2]。該菌引起的豬丹毒是一種急性、熱性、人畜共患傳染病，其特征主要表現(xiàn)為急性敗血癥、亞急性疹塊型和慢性疣狀心內(nèi)膜炎及多發(fā)性非化膿性關(guān)節(jié)炎[3]。豬丹毒廣泛流行于世界各地，也是我國(guó)主要的豬傳染病之一，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

紅斑丹毒絲菌血清型眾多，迄今已確認(rèn)的血清型有26個(gè)（1a、1b、2～24及N型），約80%以上的豬源分離菌株屬于1型（包括1a和1b）和2型[5]。不同血清型菌株的致病力不同，1型毒力最強(qiáng)，主要引起急性敗血型豬丹毒；2型毒力較弱，主要與疹塊型或關(guān)節(jié)炎型豬丹毒有關(guān)[5]。紅斑丹毒絲菌spaA 基因編碼的產(chǎn)物為表面保護(hù)性抗原（surface protect antigen，Spa）。根據(jù)基因水平和蛋白水平的差異，可將Spa分為SpaA、SpaB、SpaC 三類(lèi)。研究發(fā)現(xiàn)，SpaA 僅存在于毒力較強(qiáng)的血清型1a、1b、2、5、8、9、12、15、16、17 和N 型的菌株中，不僅具有良好的免疫原性及免疫保護(hù)功能，而且是紅斑丹毒絲菌的重要致病因子[6]。通過(guò)對(duì)spaA 基因遺傳進(jìn)化的研究，可從基因水平上分析紅斑丹毒絲菌分離株之間的差異[7]。

2016年10月，云南省昆明市某規(guī)?；N豬場(chǎng)飼養(yǎng)的懷孕母豬突然發(fā)病，精神沉郁，食欲不振，體溫升高至41℃～41.5℃。病程較長(zhǎng)的豬全身頸部、背部、腹部皮膚有大面積紅色疹塊，食欲下降并伴隨嘔吐，結(jié)膜充血，糞便干硬，并附有粘液。臨死前腋下、股內(nèi)、腹內(nèi)有不規(guī)則鮮紅色斑塊，指壓褪色后融合一起（圖1A）。為了查明病因，對(duì)送檢病死豬尸體進(jìn)行解剖，可見(jiàn)肺臟腫大、出血（圖1B），腸系膜淋巴結(jié)腫大、出血（圖1C），肺部切開(kāi)有氣泡產(chǎn)生（圖1D）。采集病死豬肺臟、脾臟、腦組織、淋巴結(jié)等內(nèi)臟組織及流產(chǎn)胎兒組織，進(jìn)行豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細(xì)小病毒、偽狂犬病毒、日本乙型腦炎病毒、豬圓環(huán)病毒2型病毒、豬流產(chǎn)衣原體、多殺性巴氏桿菌及剛地弓形蟲(chóng)的PCR或real-time PCR檢測(cè)。同時(shí)進(jìn)行致病菌的分離培養(yǎng)和鑒定，最終分離鑒定出1株豬紅斑丹毒絲菌。根據(jù)藥敏測(cè)定結(jié)果選用敏感藥物對(duì)豬群進(jìn)行預(yù)防及治療，效果顯著，及時(shí)有效地控制了本病的擴(kuò)散及蔓延。

圖1 病死豬病理變化Fig.1 Pathological change of sick pigs

1 材料與方法

1.1 樣品 昆明市某規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)送檢死亡母豬肝臟、肺部、淋巴組織、胎盤(pán)及流產(chǎn)胎兒。

1.2 主要試劑營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、革蘭氏染液購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；Gibic新生犢牛血清、病毒基因組RNA提取試劑盒（MagMAX-96 viral RNA isolation kit）、RNA病毒反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher SCIENTIFIC公司；病毒基因組RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Ambion生物技術(shù)有限公司；病毒DNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA生物技術(shù)有限公司；2×Plus Taq酶、DNA Marker DL2000均購(gòu)自天根生物技術(shù)（北京）有限公司；一步法RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物（TaKaRa）生物技術(shù)有限公司；半自動(dòng)細(xì)菌生化鑒定及藥敏檢測(cè)系統(tǒng)ATB及梅里埃鏈球菌生化快速鑒定試條、獸醫(yī)細(xì)菌藥敏鑒定試條均購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明成年小白鼠8只購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 引物、探針豬瘟病毒、偽狂犬病毒、乙型腦炎病毒、豬細(xì)小病毒及豬圓環(huán)病毒2型檢測(cè)引物及探針由云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)。檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲型毒株及美洲型高致病性毒株、經(jīng)典毒株及通用型引物和探針，以及豬流產(chǎn)（鸚鵡熱）衣原體，豬紅斑丹毒絲菌，多殺性巴氏桿菌，剛地弓形蟲(chóng)的檢測(cè)引物及探針參考文獻(xiàn)[8-16]。以上引物及探針均分別由上海Invitrogen生物科技有限公司、上海GENEray生物科技有限公司及昆明碩擎生物科技有限公司合成。詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1.5 病死豬組織勻漿病毒核酸及細(xì)菌基因組DNA的抽提

1.5.1 病毒基因組（RNA/DNA）的抽提 取病死懷孕母豬及流產(chǎn)胎兒大腦、肺臟、脾臟、肺門(mén)淋巴結(jié)、肝臟、腎臟及胎盤(pán)組織勻漿，反復(fù)凍融3次后，4500×g離心10 min，取上清液按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，提取組織病料病毒DNA或 RNA樣品，所抽提病毒核酸樣品均-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 細(xì)菌基因組DNA的抽提 取組織病料上清或分離培養(yǎng)細(xì)菌菌落，按照細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、日本乙型腦炎病毒、巴氏桿菌、剛地弓形蟲(chóng)的PCR檢測(cè)分別采用云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建立的豬瘟病毒real-time PCR和豬細(xì)小病毒、乙型腦炎、偽狂犬及圓環(huán)病毒2型PCR檢測(cè)方法進(jìn)行，參考文獻(xiàn)中的豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲型及美洲型高致病性毒株、經(jīng)典毒株[8-9]，豬流產(chǎn)衣原體[10]，布氏桿菌[11]及剛地弓形蟲(chóng)[12-13]PCR及real-time PCR檢測(cè)方法對(duì)送檢樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 致病菌的分離培養(yǎng)及鑒定

1.7.1 致病菌的分離培養(yǎng) 無(wú)菌采集病死懷孕母豬肺臟組織樣品，劃線接種于新生牛血清瓊脂平板上，置CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h后，挑取單個(gè)菌落，重新劃線接種于新生牛血清瓊脂平板上，同樣于CO2培養(yǎng)箱37℃倒置培養(yǎng)24 h，若有菌落生長(zhǎng)，則挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢。

1.7.2 分離菌株昆明小白鼠致病性試驗(yàn) 取適量純化的分離菌株菌落，用無(wú)菌生理鹽水懸浮混合均勻后，測(cè)定細(xì)菌濃度，并稀釋至濃度為1.5×108個(gè)/mL，每只昆明小白鼠腹腔接種0.2 mL，共接種6只。同時(shí)給2只昆明小白鼠腹腔注射同等劑量的無(wú)菌生理鹽水，作為對(duì)照組。接種后觀察并記錄小白鼠的發(fā)病及死亡情況，解剖觀察病理變化，并進(jìn)行菌株的分離。1.7.3 分離菌株的細(xì)菌生化及藥敏鑒定 選用法國(guó)梅里埃鏈球菌生化快速鑒定試條對(duì)分離菌株進(jìn)行細(xì)菌生化鑒定，具體操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，接種后置于濕盒內(nèi)，37℃培養(yǎng)4 h±30 min后，讀取結(jié)果。選用法國(guó)梅里埃獸醫(yī)細(xì)菌藥敏鑒定試條對(duì)分離菌株進(jìn)行細(xì)菌藥敏鑒定，具體操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，接種后置于濕盒內(nèi)37℃培養(yǎng)18～24 h后，讀取結(jié)果。

表1 引物、探針信息表Table 1 Primers and probes used in this paper

1.8 分離菌株細(xì)菌基因組16SrRNA的擴(kuò)增及序列分析參考文獻(xiàn)合成細(xì)菌基因組16S rRNA基因特異引物Erysipel-16SrRNA-1345-F、R，擴(kuò)增所提取的細(xì)菌基因組DNA。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×Taq PCR Master mix 12.5 μL、上下游引物 E-16SrRNA-1345-F和E-16SrRNA-1345-R各1 μL、模板DNA 4 μL、滅菌ddH2O 6.5μL，混勻，短暫離心后上機(jī)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃ 1min，60℃ 50 s，72℃ 2 min運(yùn)行35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)合成細(xì)菌16S rRNA基因通用引物16S-27F、16S-1492R，擴(kuò)增所提取的細(xì)菌基因組DNA。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq PCR Master mix 12.5 μL、上下游引物16S-27F(A)和16S-1492R(T)各1 μL、模板DNA3 μL、滅菌ddH2O 7.5 μL，混勻，短暫離心后上機(jī)。反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性3min；95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s運(yùn)行35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收純化，送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序后進(jìn)行序列分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒毒株、豬瘟病毒、偽狂犬病毒、多殺性巴氏桿菌、豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、日本乙型腦炎病毒及剛地弓形蟲(chóng)的PCR檢測(cè)樣品經(jīng)豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒歐洲型及美洲型、高致病性及經(jīng)典毒株、豬瘟病毒、偽狂犬病毒、巴氏桿菌、日本乙型腦炎病毒、剛地弓形蟲(chóng)PCR檢測(cè)，其結(jié)果全為陰性（圖略）。

2.2 細(xì)菌的培養(yǎng)及染色分離菌株在胎牛血清平板上生長(zhǎng)緩慢，菌落細(xì)小、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊。染色后鏡檢顯示菌體為革蘭氏染色陽(yáng)性，呈球狀、短桿狀，單個(gè)或雙菌存在（圖1）。

圖1 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig.1 Gram stain results of the isolates

2.3 分離菌株細(xì)菌基因組RNA的特異擴(kuò)增、非特異擴(kuò)增及序列分析結(jié)果結(jié)果顯示，Erysipel-16S rRNA-1345-F/R引物擴(kuò)增出特異型條帶，條帶大小為1345 bp（圖2A）。16S-27F(A)/16S-1492R(T)引物擴(kuò)增出特異性條帶，條帶大小為1415 bp（圖2B），測(cè)序結(jié)果顯示分離株與豬紅斑丹毒絲菌參考菌株同一性達(dá)97%，表明該菌株為豬紅斑丹毒絲菌，命名為云南YNKMYZS-2016株。

圖2 分離菌株的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 PCR results of the isolate

2.4 分離菌株16S rRNA序列分析結(jié)果分離菌株與豬紅斑丹毒絲菌參考菌株Fujisawa株、GXBY-1株、SY1027株及WH13013株同源性高達(dá)100%，與KGBB1株、KG-BB2株同源性達(dá)96.3%（圖3）?；诜蛛x菌株16S rRNA基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)顯示，分離菌株與GenBank中的豬紅斑丹毒絲菌參考菌株Fujisawa株、GXBY-1株、SY1027株及WH13013株同屬于一個(gè)進(jìn)化分支，而KG-BB1株、KG-BB2株同屬于另一進(jìn)化分支（圖4）。

圖3 豬紅斑丹毒絲菌16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果Fig.3 The alignment results based on 16S rRNA gene sequence of Erysipelothrix rhusiopathiae

圖4 豬紅斑丹毒絲菌16S rRNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 The phylogenetic tree construction based on 16S rRNA gene sequences of Erysipelothrix rhusiopathiae

2.5 生化鑒定與藥敏試驗(yàn)結(jié)果生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。選擇28種較常見(jiàn)的抗生素藥敏紙片對(duì)該株菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，YNKMYZS-2016株對(duì)青霉素、紅霉素、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、原始霉素、苯唑西林、泰洛星、頭孢噻吩、頭孢哌酮、呋喃妥因敏感，對(duì)林可霉素、多粘菌素 E、復(fù)方新諾明、鏈霉素、磺胺甲惡唑、大觀霉素、氟甲喹、卡那霉素、奧索利酸、慶大霉素、依氟沙星、安普霉素、氯霉素、夫西地酸、四環(huán)素、利福平、多西環(huán)素、甲硝唑耐藥，詳見(jiàn)表3。

表2 豬紅斑丹毒絲菌分離菌株生化反應(yīng)結(jié)果Table 2 The results of biochemical identi fication for Erysipelothrix rhusiopathiae YNKMYZS-2016

表3 豬紅斑丹毒絲菌分離菌株對(duì)28種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of antibiotic sensitivity test for Erysipelothrix rhusiopathiae YNKMYS-2016

2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果6只實(shí)驗(yàn)組昆明小白鼠接種分離株YNKMYZS-2016株2 h后精神萎頓，飲食欲廢絕，打堆，接種后24～53 h內(nèi)死亡。剖檢死亡小白鼠后可見(jiàn)肺臟、肝臟、腎臟及脾臟出血，并從肝臟及脾臟穿刺樣品分離到同一細(xì)菌，而正常對(duì)照組昆明小白鼠內(nèi)臟器官無(wú)異常病理變化，肝臟及脾臟穿刺樣品未分離到病原細(xì)菌。

2.7 討論目前，國(guó)內(nèi)有許多傳染性疫病可引起豬急性死亡，例如，高致病性繁殖與呼吸道綜合征、急性豬瘟、豬丹毒、豬肺疫、豬梭菌病、沙門(mén)氏菌、李氏桿菌和豬鏈球菌病等，以單獨(dú)感染或混合感染的形式出現(xiàn)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[14]。在20世紀(jì)80年代和90年代初，豬丹毒與豬瘟、豬肺疫并稱(chēng)為中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的三大傳染病，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。隨著規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)的發(fā)展，豬丹毒似乎逐漸談出了人們的視線，急性典型的臨床病例發(fā)生比例越來(lái)越低，很多豬場(chǎng)已經(jīng)停止使用豬丹毒疫苗。但近幾年，在江西、浙江、湖南、四川、云南、廣州、福建等省均有豬丹毒散發(fā)的報(bào)道[15]，造成不同生長(zhǎng)階段豬群發(fā)病死亡，而且隨著時(shí)間的推移，豬丹毒有從南向北發(fā)展的趨勢(shì)，并日益嚴(yán)重。由于豬丹毒桿菌具有廣泛的宿主，病豬和帶菌豬是最主要的傳染源，細(xì)菌可通過(guò)分泌物和排泄物污染及傳播，且對(duì)外界環(huán)境的抵抗力很強(qiáng)，一旦侵入環(huán)境中，便會(huì)通過(guò)各種途徑傳播至其他地區(qū)。養(yǎng)殖戶(hù)多年放棄免疫豬丹毒疫苗，使得其發(fā)病率逐漸呈上升趨勢(shì)，且豬紅斑丹毒絲菌常與豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸道綜合征、豬圓環(huán)病毒、偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌及副豬嗜血桿菌等病原共同感染或繼發(fā)感染，加重本病的發(fā)生與流行。

本研究同時(shí)使用法國(guó)梅里埃API Coryne鑒定試條（24～48 h鑒定棒狀桿菌和相關(guān)菌種）和API rapid ID 32 Strep鑒定試條（快速鏈球菌和相關(guān)菌種鑒定）對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，分離菌株為豬紅斑丹毒絲菌。兩種試紙條鑒定的置信度非常高，ID%值均達(dá)到99%以上。細(xì)菌生化鑒定歷來(lái)是細(xì)菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，本研究對(duì)分離菌株的生化鑒定獲得了非常高的置信度，表明當(dāng)前流行的豬紅斑丹毒絲菌在生化特性上具有較高的保守性。細(xì)菌16S rRNA序列比對(duì)結(jié)果與生化鑒定結(jié)果也高度一致，均顯示分離菌為豬紅斑丹毒絲菌。由于細(xì)菌16S rRNA 基因的PCR檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)合快速、高效的商業(yè)化測(cè)序技術(shù)服務(wù)，已成功地應(yīng)用于多種細(xì)菌的鑒定，并逐漸成為細(xì)菌快速鑒定的重要方法。

青霉素一直是抗豬丹毒的首選藥物，本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該株豬紅斑丹毒絲菌（YNKMYZS-2016）對(duì)青霉素及頭孢類(lèi)抗生素依然敏感，除了青霉素及頭孢類(lèi)抗生素可供選擇外，還可參考選擇呋喃妥因或紅霉素（大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)）進(jìn)行預(yù)防和治療。

本次豬丹毒主要發(fā)生于生產(chǎn)母豬及育肥豬，暴發(fā)初期臨床表現(xiàn)為發(fā)病急、死亡快，死后皮膚無(wú)出血、發(fā)紺及豬丹毒典型的“打火印”特征，直至部分病程較長(zhǎng)的發(fā)病豬皮膚才出現(xiàn)指壓褪色的“打火印”，因此在發(fā)病初期臨床上很難確診。此外，豬丹毒與豬繁殖與呼吸道綜合征、豬瘟、偽狂犬、豬弓形蟲(chóng)病及豬肺疫等的臨床癥狀和病理變化相似，極易發(fā)生誤診，不能及時(shí)確診會(huì)給豬場(chǎng)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，通過(guò)疫苗預(yù)防接種可以降低豬丹毒的發(fā)生率及死亡率，但傳統(tǒng)的滅活疫苗、弱毒疫苗存在較多缺陷，對(duì)豬丹毒的免疫保護(hù)效果不理想。當(dāng)前流行的豬紅斑丹毒絲菌存在一定程度的抗原性變異，如果疫苗產(chǎn)品仍使用幾十年前的菌種，疫苗制品的抗原與流行菌株抗原匹配度不理想的話，將會(huì)出現(xiàn)疫苗產(chǎn)品保護(hù)效率較低的結(jié)果。因此，分離獲得當(dāng)前豬紅斑丹毒絲菌流行菌株，進(jìn)行新型疫苗產(chǎn)品的研發(fā)，對(duì)于更有效地預(yù)防和控制豬丹毒是十分必要的。