一株產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌的篩選與鑒定

趙天宇，郭一柯，劉霽逸，龐茂達(dá)

（1.金陵中學(xué)，江蘇南京210005；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，江蘇南京210014；3.江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，江蘇南京210014）

細(xì)菌素（bacteriocin）是某些細(xì)菌由核糖體途徑合成的具有抗菌活性的多肽或蛋白質(zhì)。大多數(shù)細(xì)菌素具有高效、無(wú)毒、無(wú)抗藥性、無(wú)副作用、無(wú)殘留、熱穩(wěn)定好、不影響食品風(fēng)味等優(yōu)點(diǎn)。由于乳酸菌是“公認(rèn)安全”的菌株，使得乳酸菌細(xì)菌素在食品保鮮上的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注[1]。越來(lái)越多的研究表明，乳酸菌及其代謝產(chǎn)物細(xì)菌素對(duì)奶制品、面包、肉制品、水產(chǎn)品等多種食品均有良好的保鮮效果[2]。乳酸鏈球菌素（nisin）是目前研究最多的乳酸菌細(xì)菌素，在50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[3]。此外，促腸活動(dòng)素AS-48、米酒乳桿菌素P、植物乳桿菌素163等細(xì)菌素也因能抑制腐敗菌和食源性致病菌等微生物的生長(zhǎng)，顯示出很好的應(yīng)用潛力[4-6]。但是目前商品化的細(xì)菌素防腐劑仍然較少，Nisin是被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（U.S.Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認(rèn)可的唯一作為食品防腐劑的細(xì)菌素，也是我國(guó)批準(zhǔn)使用的唯一細(xì)菌素防腐劑[7]。在歐洲，商品化的細(xì)菌素也只有尼爾斯克公司（Danisco）的Nisin和奎斯特公司（Quest）生產(chǎn)的片球菌素PA-1[8]。

已報(bào)道的細(xì)菌素大多數(shù)抗菌譜較窄，對(duì)革蘭氏陰性菌抑菌效果較差，這大大限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。因此，篩選廣譜高效的細(xì)菌素具有更廣闊的應(yīng)用前景，已成為現(xiàn)在關(guān)注的熱點(diǎn)。我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品種類(lèi)多樣，為研究人員篩選抑菌譜廣、抑菌活性強(qiáng)的細(xì)菌素產(chǎn)生菌提供了很好的條件。本文以不動(dòng)桿菌、熱殺索絲菌、大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌為指示菌，從傳統(tǒng)酸白菜中篩選出1株產(chǎn)廣譜細(xì)菌素的乳酸菌，通過(guò)傳統(tǒng)生理生化方法和分子生物學(xué)方法，對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，并研究了細(xì)菌素部分生物學(xué)性質(zhì)和抑菌譜，為乳酸菌細(xì)菌素的商業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

傳統(tǒng)酸白菜：沈陽(yáng)裕豐腌菜廠(chǎng)。

1.2 指示菌

革蘭氏陽(yáng)性菌：蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）AS1.1846、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）CMCC 63202、熱殺索絲菌（Brochothrix thermosphacta）ATCC 11509、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19114、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）CMCC 28000、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25923。

革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922、鮑氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）、熒光假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）AS 1.2620、腸炎沙門(mén)氏菌（Salmonella enteritidis）CICC 21527、鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium）CMCC 51005。

試驗(yàn)所用菌株均為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所畜產(chǎn)品污染監(jiān)測(cè)及預(yù)防研究室保存。

1.3 試劑

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、K2HPO42.0 g/L、檸檬酸二銨2.0 g/L、乙酸鈉5.0g/L、葡萄糖20.0g/L、MgSO4·H2O0.58g/L、MnSO4·4H2O 0.25 g/L、吐溫-80 1.0 mL，蒸餾水 1 L，調(diào)節(jié) pH 值至6.2±0.2，7×104Pa滅菌 20 min；LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L、酵母提取物 5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L、pH 7.0±0.2，1×105Pa滅菌 15 min；胰蛋白酶（2 500 units/mg）、蛋白酶 K（30 units/mg）、木瓜蛋白酶（2 400 units/mg）、胃蛋白酶（2 000 units/mg）；以上試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)，購(gòu)自南京鼎思生物技術(shù)有限公司。

革蘭氏染色試劑盒：杭州百思生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒：美國(guó)Omega公司；Taq DNA聚合酶、GelExtractionKit：南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.4 乳酸菌的分離純化

無(wú)菌鑷子取25 g酸菜樣品接種到含100 mL生理鹽水的三角瓶中，振蕩培養(yǎng)30 min。采用常規(guī)的稀釋涂布法分離乳酸菌。樣品用無(wú)菌生理鹽水10倍倍比稀釋?zhuān)?10-3、10-4、10-5梯度的樣品各 100 μL 涂布于MRS固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48 h。隨機(jī)挑取不同的菌落，在MRS固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)培養(yǎng)，以得到形態(tài)單一的單菌落。

1.5 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的初篩

分離純化得到的乳酸菌在MRS中傳代培養(yǎng)2次，10 000×g離心10 min，收集發(fā)酵上清液。以大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌為指示菌，通過(guò)瓊脂擴(kuò)散法篩選具有抑菌活性的乳酸菌[9]。具體方法如下：取1 mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的指示菌，接種于100 mL冷卻至50℃左右的LB固體培養(yǎng)基，混勻后倒入直徑為20 cm的無(wú)菌平板，制成帶指示菌的固體培養(yǎng)基。用孔徑10 mm的打孔器打孔，每孔加入100 μL發(fā)酵上清液。37℃培養(yǎng)8 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。選取抑菌圈直徑大于13 mm的乳酸菌進(jìn)行復(fù)篩。

1.6 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的復(fù)篩

以革蘭氏陽(yáng)性菌如蠟樣芽孢桿菌、熱殺索絲菌，革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、鮑氏不動(dòng)桿菌為指示菌進(jìn)一步篩選具有廣譜抗菌活性的菌株。選取初篩結(jié)果為陽(yáng)性的菌株進(jìn)行發(fā)酵。為了排除H2O2和有機(jī)酸的干擾，發(fā)酵后上清液用過(guò)氧化氫酶處理，并用5 mol/L NaOH將發(fā)酵上清的pH值調(diào)至5.5。抑菌平板用打孔器打孔，每孔加入100 μL發(fā)酵上清液。37℃培養(yǎng)8 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

1.7 乳酸菌的鑒定

根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化特征以及分子生物學(xué)對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生菌株進(jìn)行菌種鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定是通過(guò)觀察培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)和革蘭氏染色后的菌體特征進(jìn)行；理化特性分析主要以過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)為主，試驗(yàn)方法和結(jié)果分析參照《乳酸細(xì)菌分類(lèi)鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[10]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11]。分子生物學(xué)鑒定通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）對(duì)菌株16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。

16S rRNA基因擴(kuò)增引物序列：上游AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，下游 GGTTACCTT GTTACGACTT，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：2×PCR Mix 25 μL；10 μmol/L 上、下游引物各2 μL，DNA 模板 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物回收后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上的GenBank序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 BLAST分析[12]。

1.8 細(xì)菌素性質(zhì)的初步研究

1.8.1 細(xì)菌素的蛋白酶敏感性

將發(fā)酵上清分別用1.0 mg/mL的胰蛋白酶[pH 7.5，10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）]、蛋白酶 K（pH 7.5，50 mmol/L Tris-HCl）、木瓜蛋白酶（pH 7.5，10 mmol/L PBS）和胃蛋白酶（pH 2.0，0.1 mol/L HCl）進(jìn)行處理，37℃溫育30 min后，100℃加熱5 min終止反應(yīng)[13]。隨后將樣品調(diào)節(jié)至初始pH 3.8，測(cè)定抑菌活性，以未加入酶的發(fā)酵上清液作對(duì)照，指示菌為蠟樣芽孢桿菌。

1.8.2 細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性

菌株發(fā)酵上清液分別在60、80、100、121℃下處理30 min，冷卻后用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。以未加熱的發(fā)酵上清液作為對(duì)照。

1.8.3 細(xì)菌素的pH值穩(wěn)定性

用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵上清液pH值為2～8，37℃靜置30 min，用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。以未調(diào)節(jié)pH值的發(fā)酵上清（pH 3.8）為對(duì)照。

1.9 抑菌譜的測(cè)定

以蠟樣芽孢桿菌AS1.1846、短小芽孢桿菌CMCC 63202、熱殺索絲菌ATCC 11509、單增李斯特菌ATCC 19114、藤黃微球菌CMCC 28000、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、大腸桿菌ATCC 25922、鮑氏不動(dòng)桿菌、熒光假單胞菌AS 1.2620、腸炎沙門(mén)氏菌CICC 21527、鼠傷寒沙門(mén)氏菌CMCC 51005為指示菌，排除酸性物質(zhì)的干擾后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，37℃靜置培養(yǎng)8 h，游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

1.10 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行處理分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示。用Graphpad Prism 7.0軟件繪制圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離和篩選

采用瓊脂擴(kuò)散法篩選產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌，從208株分離得到的乳酸菌中初篩得到83株對(duì)大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌有抑菌活性的乳酸菌。為排除H2O2和有機(jī)酸的干擾，復(fù)篩時(shí)在發(fā)酵上清液加入過(guò)氧化氫酶，并將pH值調(diào)節(jié)至5.5。復(fù)篩后得到5株對(duì)蠟樣芽孢桿菌、熱殺索絲菌、大腸桿菌和鮑氏不動(dòng)桿菌均有抑菌效果的乳酸菌，從中挑選抑菌活性最好的5號(hào)菌株（命名為SY5）進(jìn)行后續(xù)的研究。SY5對(duì)4種指示菌的抑菌圈大小見(jiàn)圖1。

2.2 乳酸菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株SY5在MRS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，呈乳白色、凸起、邊緣整齊、表面光滑的小菌落如圖2A。革蘭氏染色后鏡檢為藍(lán)紫色，無(wú)鞭毛和芽孢，顯示為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌如圖2B。

圖1 菌株SY5對(duì)4種指示菌的抑菌圈Fig.1 The inhibition zone sizes of strain SY5 against four indicator bacteria

圖2 菌株SY5的菌落形態(tài)和革蘭氏染色鏡檢圖Fig.2 Colony morphology and Gram staining of strain SY5

2.2.2 生理生化鑒定

菌株SY5過(guò)氧化氫酶陰性，能在15℃生長(zhǎng)，不能在45℃生長(zhǎng)，發(fā)酵葡萄糖但不產(chǎn)氣，這些特征說(shuō)明SY5屬于同型發(fā)酵乳酸菌。糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，菌株SY5發(fā)酵木糖、纖維二糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、甘露糖、棉子糖、山梨醇、蔗糖、海藻糖、核糖、葡萄糖，不發(fā)酵阿拉伯糖和鼠李糖，根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)，菌株SY5應(yīng)屬戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）。

表1 菌株SY5的糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of sugar fermentation experiment of strain SY5

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

利用16S rRNA基因引物對(duì)菌株SY5基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到一條1 500 bp左右的條帶見(jiàn)圖3。

圖3 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Electrophoresis of PCR-amplified products of 16S rRNA gene

測(cè)序結(jié)果拼接后序列大小為1 428 bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌株的16S rRNA基因與戊糖乳桿菌LBa相似性為100%。結(jié)合以上生理生化和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定該菌株為戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）。

2.3 乳酸菌細(xì)菌素性質(zhì)分析

乳酸菌發(fā)酵上清液經(jīng)蛋白酶作用后的抑菌效果見(jiàn)表2。

由表2可知，經(jīng)胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K處理后，戊糖乳桿菌SY5發(fā)酵上清抑菌效果明顯下降，特別是胃蛋白酶和蛋白酶K處理后使其完全失去抑菌活性，由此可見(jiàn)，戊糖乳桿菌SY5發(fā)酵上清的抑菌物質(zhì)具有蛋白質(zhì)的性質(zhì)。由于試驗(yàn)設(shè)計(jì)上排除了有機(jī)酸和過(guò)氧化氫等的干擾，可確定此抑菌物質(zhì)是一種細(xì)菌素。

殘留的抑菌活性如表2所示，戊糖乳桿菌SY5上清液經(jīng)不同溫度處理后，隨著作用溫度的升高，細(xì)菌素的抑菌活性有所下降，但在60℃30 min后，仍然保留90%以上的抑菌活性。121℃處理30 min后，也依然保留82.7%的抑菌活性，說(shuō)明戊糖乳桿菌SY5產(chǎn)生的細(xì)菌素具有很好的熱穩(wěn)定性。

戊糖乳桿菌SY5產(chǎn)生的細(xì)菌素pH穩(wěn)定性如圖4所示。

圖4 細(xì)菌素的pH值穩(wěn)定性Fig.4 pH stability of bacteriocin

該細(xì)菌素在pH＜4.0的酸性條件下有很好的抑菌活性；pH＞4.0以后，隨著pH值的增加，抑菌活性不斷減弱；pH＞8.0以后，抑菌活性基本消失。

2.4 抑菌譜的測(cè)定

戊糖乳桿菌SY5細(xì)菌素的抑菌譜見(jiàn)表3。

表3 戊糖乳桿菌SY5細(xì)菌素的抑菌譜Table 3 Antimicrobial spectrum of Lactobacillus pentosus SY5 bacteriocin

如表3所示，戊糖乳桿菌SY5對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌如蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特菌、藤黃微球菌的有明顯的抑制效果，抑菌圈直徑大于18 mm；對(duì)短小芽孢桿菌、熱殺索絲菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鮑氏不動(dòng)桿菌、腸炎沙門(mén)氏菌的抑菌效果相當(dāng)，抑菌圈直徑在13 mm～17 mm；對(duì)熒光假單胞菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抑菌圈小于13 mm。整體而言，戊糖乳桿菌SY5對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制效果優(yōu)于對(duì)革蘭氏陰性菌。

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，利用乳酸菌及其代謝產(chǎn)物細(xì)菌素對(duì)食品中腐敗菌和致病菌的抑制作用，來(lái)延長(zhǎng)食品貯存期、加強(qiáng)食品安全的生物保藏法逐漸被重視。絕大多數(shù)的乳酸菌細(xì)菌素如nisin只對(duì)親緣關(guān)系較近的革蘭氏陽(yáng)性菌有較好的抑菌效果，大大限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。因此篩選得到對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有抑菌效果的細(xì)菌素就顯得非常重要。酸菜發(fā)酵是一個(gè)由乳酸菌主導(dǎo)的過(guò)程，其中以腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為最主要的優(yōu)勢(shì)菌種，因此發(fā)酵酸菜是篩選乳酸菌的天然材料。Zhao等[14]從東北蘿卜泡菜中篩選出1株具有抑制多種G+菌及G-菌的廣譜抑菌活性的植物乳桿菌。奎夢(mèng)漪等[15]從云南自然發(fā)酵酸菜液中分離出12株乳酸菌，4株性狀優(yōu)良的乳酸菌經(jīng)鑒定后為植物乳桿菌、腸膜明串珠菌和短乳桿菌。

本試驗(yàn)利用瓊脂擴(kuò)散法從傳統(tǒng)酸菜中分離出一株具有廣譜抑菌活性的乳酸菌SY5，經(jīng)鑒定為戊糖乳桿菌。戊糖乳桿菌最初被鑒定為植物乳桿菌，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用rec A基因和發(fā)酵戊糖的性質(zhì)將其單獨(dú)劃分為戊糖乳桿菌。由于具有特殊的抗菌和調(diào)節(jié)免疫功能等益生性質(zhì)，戊糖乳桿菌在乳制品、發(fā)酵谷物蔬菜和發(fā)酵肉制品等中廣泛存在，同時(shí)在功能性食品的開(kāi)發(fā)中也發(fā)揮重要作用[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)，SY5能夠產(chǎn)生具有熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性的細(xì)菌素，對(duì)蠟樣芽孢桿菌和大腸桿菌等條件致病菌，以及熱殺索絲菌和鮑氏不動(dòng)桿菌等常見(jiàn)的肉制品腐敗菌都有很好的抑制效果，屬于廣譜的細(xì)菌素。與目前已知的大多細(xì)菌素一樣，具有蛋白酶敏感性。這種性質(zhì)保證了細(xì)菌素在經(jīng)食物進(jìn)入人體后，容易被體內(nèi)的蛋白酶降解，不會(huì)對(duì)機(jī)體帶來(lái)危害[18]。由于乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中不僅產(chǎn)生細(xì)菌素，還會(huì)產(chǎn)生具有抑菌活性的乳酸等有機(jī)酸。因此，復(fù)篩時(shí)在發(fā)酵上清液加入過(guò)氧化氫酶，并把pH值調(diào)節(jié)到5.5，以排除H2O2和有機(jī)酸的干擾。熱穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，該細(xì)菌素121℃處理30 min后，依然保留80%以上的抑菌活性，適合應(yīng)用于食品加工和貯藏過(guò)程，這與已報(bào)道的 sakacin C2[19]、ent35-MccV[20]等細(xì)菌素性質(zhì)相同。此外，該細(xì)菌素具有耐酸不耐堿的性質(zhì)，適合在酸性食品中應(yīng)用。

綜上，本文從傳統(tǒng)酸菜中分離出一株具有廣譜抑菌活性的戊糖乳桿菌，在食品防腐等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。未來(lái)的研究集中在分離純化出戊糖乳桿菌SY5產(chǎn)生的細(xì)菌素，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和抑菌機(jī)制探究，為其應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。