阿那曲唑陰道環(huán)中有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的方法學(xué)研究

邱順晨 楊 森 劉振齊 谷翊群 寧美英*

1.國家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所(北京，100081); 2.中國人民武裝警察部隊(duì)北京市總隊(duì)

阿那曲唑(ATZ)是一種強(qiáng)效的選擇性三唑類芳香化酶抑制劑，為第三代芳香化酶抑制劑的代表藥物，它具有選擇性高，特異性強(qiáng)，副作用明顯降低等特點(diǎn)。能有效抑制細(xì)胞色素P-450 所依賴的芳香化酶，從而阻斷雌激素的生物合成那曲唑口服片劑常用于治療經(jīng)他莫昔芬及其它抗雌激素療法治療后仍不能控制的激素敏感型絕經(jīng)后晚期乳腺癌，以及絕經(jīng)后婦女的早期乳腺癌，有良好的治療效果[3-5]。臨床研究表明，1 mg的阿那曲唑與復(fù)方口服避孕藥(0.1 mg/d左炔諾孕酮+0.02 mg/d炔雌醇)聯(lián)用可緩解子宮內(nèi)膜異位癥造成的盆腔疼痛[6]。因此，阿那曲唑有望成為子宮內(nèi)膜異位癥的治療藥物。目前已上市的阿那曲唑劑型為片劑，考慮到子宮內(nèi)膜異位是一種慢性疾病，需長期用藥治療等問題，將阿那曲唑制備成緩釋給藥制劑成為研究熱點(diǎn)。陰道環(huán)給藥系統(tǒng)(IVR)是生殖健康領(lǐng)域常用的一種給藥劑型[7]，是由硅橡膠彈性體或熱塑性材料制成的環(huán)狀給藥裝置，具有使用方便，子宮靶向效應(yīng)，血藥濃度平穩(wěn)等特點(diǎn)?？紤]子宮內(nèi)膜異位癥的病灶部位特點(diǎn)，將阿那曲唑制成陰道環(huán)制劑，局部應(yīng)用于病灶部位，能夠達(dá)到靶向治療子宮內(nèi)膜異位癥的目的[8]。本試驗(yàn)采用了注塑成型法制備阿那曲唑陰道環(huán)，建立了阿那曲唑陰道環(huán)中有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，為阿那曲唑陰道環(huán)制劑的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

阿那曲唑原料藥(批號(hào)：S0628A，大連美侖生物技術(shù)有限公司)；MED-6382液體硅橡膠(批號(hào)80820，美國 Nusil Technology)；MED-6382固化劑(批號(hào)80820，美國 Nusil Technology)；乙腈(色譜純，批號(hào)112189，賽默飛世尓科技有限公司)；甲醇(色譜純，批號(hào)152836，F(xiàn)isher-Scientific公司)；濃鹽酸(分析純，批號(hào)20131113，北京化工廠)；氫氧化鈉(分析純，批號(hào)20160619，北京化工廠)；純水(純凈水，批號(hào)20170309，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

1.2 儀器

Sartorius-BT224S 電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；CSR-4-10 超純水機(jī)(北京愛斯泰克科技開發(fā)有限公司)；陰道環(huán)模具(北京東洛機(jī)電有限責(zé)任公司)；ED23 型烘箱(德國賓得公司)；YG120藥物光照試驗(yàn)箱(上海一恒科技有限公司)；RT5型磁力攪拌器(IKA公司)；Waters2695高效液相色譜儀(沃特世科技有限公司)；Waters2487檢測(cè)器(沃特世科技有限公司)；色譜柱(北京迪馬科技有限公司)。

1.3 阿那曲唑陰道環(huán)的制備

將陰道環(huán)模具80℃烘箱預(yù)熱15 min。稱取阿那曲唑原料藥0.8 g，MED-6382硅膠8g，混合均勻后加入固化劑，繼續(xù)攪拌15 s?？焖賹⒒旌衔锛尤氲?0 ml注射器中，勻速且快速注入到預(yù)熱好的模具中。將模具放到80 ℃烘箱中加熱30 min，成型后開模取出。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1色譜條件色譜柱，Diamonsil C18(2) (250mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相，乙腈-水(42:58，v/v)；阿那曲唑的檢測(cè)波長，210 nm；柱溫，35℃；流速，1.0 ml/min；進(jìn)樣體積，20 μl。

1.4.2供試品溶液的配制取阿那曲唑陰道環(huán)，切成0.5 mm薄片，置于裝有100 ml甲醇的錐形瓶中，室溫下磁力攪拌24 h， 經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過。取續(xù)濾液0.5 ml于50 ml量瓶中，用乙腈-水(42:58，v/v)稀釋至刻度，搖勻，作為阿那曲唑的供試品溶液，于4 ℃冷藏備用。

1.4.3自身對(duì)照溶液的配制精密量取阿那曲唑供試品溶液1.0 ml，置于100 ml量瓶中，用乙腈-水(42:58，v/v)稀釋至刻度，搖勻，為阿那曲唑?qū)φ杖芤?，?℃冷藏備用。

1.5 專屬性試驗(yàn)

1.5.1空白干擾試驗(yàn)按照1.3的方法，制備兩個(gè)空白陰道環(huán)。將其均勻切成薄片(厚度0.5 mm)，分別置于裝有100 ml甲醇的具塞錐形瓶中，磁力攪拌24 h，經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過，按照1.4.2配制供試品溶液樣品2份，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。

1.5.2酸破壞取阿那曲唑陰道環(huán)，切成0.5 mm薄片，置于具塞錐形瓶中，再加1 mol/L鹽酸溶液適量，完全浸泡陰道環(huán)薄片，于室溫放置24 h，加0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)至中性，加100 ml甲醇。室溫下磁力攪拌24 h，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過， 取續(xù)濾液1 ml用乙腈-水(42:58，v/v)稀釋成100 ml，搖勻，HPLC進(jìn)樣記錄峰面積數(shù)據(jù)。

1.5.3堿破壞取阿那曲唑陰道環(huán)，切成0.5 mm 薄片，置于具塞錐形瓶中，加入1 mol/L NaOH溶液適量，完全浸泡陰道環(huán)薄片，于室溫放置24 h， 加0.1 mol/L 鹽酸溶液調(diào)至中性，再加100 ml甲醇。然后同1.5.2方法制備供試品溶液，HPLC進(jìn)樣記錄峰面積數(shù)據(jù)。

1.5.4氧化破壞取阿那曲唑陰道環(huán)，切成0.5 mm薄片，加3% 過氧化氫溶液適量，完全浸泡陰道環(huán)薄片，室溫放置8 h，加100 ml甲醇。然后同1.5.2方法制備供試品溶液，HPLC進(jìn)樣記錄峰面積數(shù)據(jù)。

1.5.5高溫破壞取阿那曲唑陰道環(huán)，切成0.5 mm 薄片，置于具塞錐形瓶中，于60 ℃烘箱中放置24 h后至室溫，加100 ml甲醇。然后同1.5.2方法制備供試品溶液，HPLC進(jìn)樣記錄峰面積數(shù)據(jù)。

1.5.6光照破壞取阿那曲唑陰道環(huán)，切成0.5 mm 薄片。于(4500±500)Lx光照條件下放置48 h，置于具塞錐形瓶中，加100 ml甲醇。 然后同1.5.2方法制備供試品溶液，HPLC進(jìn)樣記錄峰面積數(shù)據(jù)。

1.6 檢測(cè)限

取阿那曲唑?qū)φ掌啡芤翰粩嘞♂?，按?.4.1色譜條件進(jìn)行檢測(cè)， 直到信噪比(S /N)為3/1，得到阿那曲唑的檢測(cè)限。

1.7 精密度試驗(yàn)

取阿那曲唑?qū)φ掌啡芤?，?.4.1的色譜條件進(jìn)樣分析，一天內(nèi)重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品，按1.4.2項(xiàng)下供試品制備方法平行制備阿那曲唑供試品溶液，按1.4.3項(xiàng)下自身對(duì)照溶液制備方法平行制備阿那曲唑自身對(duì)照溶液各6份，以1.4.1的色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

1.9 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取阿那曲唑供試品溶液，以1.4.1的色譜條件，分別于0，4，8，12，20，24 h時(shí)進(jìn)樣， 記錄主成分、有關(guān)物質(zhì)及雜質(zhì)的峰面積，考察樣品穩(wěn)定性。

1.10 有關(guān)物質(zhì)檢查

取3批阿那曲唑陰道環(huán)，分別按照1.4.2方法制備阿那曲唑供試品溶液，所得阿那曲唑供試品溶液按照1.4.3項(xiàng)制備自身對(duì)照溶液，分別精密量取20 μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10%，再精密量取供試品溶液和對(duì)照液各20 μl，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，用自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)的含量。

2 結(jié)果

2.1專屬性試驗(yàn)

2.1.1空白干擾試驗(yàn)經(jīng)過相同處理的空白陰道環(huán)提取液的HPLC圖譜如圖1 所示，在阿那曲唑的保留時(shí)間(箭頭所示，8.46 min)下無其他的吸收峰出現(xiàn)，說明空白硅橡膠輔料未對(duì)阿那曲唑的相關(guān)檢測(cè)產(chǎn)生干擾。

圖1 空白陰道環(huán)提取液(A)和阿那曲唑陰道環(huán)供試品溶液(B)在檢測(cè)條件下的HPLC圖譜

2.1.2強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果見圖2所示，樣品經(jīng)酸、堿、氧化、高溫、光照破壞后，阿那曲唑有輕微降解，但各降解產(chǎn)物峰與主要峰之間均可達(dá)到良好分離。

2.2 檢測(cè)限

由HPLC進(jìn)樣后的結(jié)果分析可知， 阿那曲唑的檢測(cè)限為3 ng/ml。

2.3 精密度試驗(yàn)

阿那曲唑?qū)φ掌分须s質(zhì)總和在1日內(nèi)的RSD為1.3%，表明方法的精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

6份供試品溶液中阿那曲中的雜質(zhì)總和的RSD為1.6%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

阿那曲唑供試品溶液在24 h內(nèi)雜質(zhì)峰面積總和的RSD為1.8% ，表明阿那曲唑的穩(wěn)定性符合相關(guān)要求。

2.6 有關(guān)物質(zhì)檢查

3批樣品定量測(cè)定結(jié)果見表1。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，所制備的3批樣品在阿那曲唑檢測(cè)條件下單雜質(zhì)和總雜質(zhì)含量均低于0.5%，符合藥典要求。

表1 阿那曲唑陰道環(huán)不同批次雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果(%)

圖2 陰道環(huán)中的阿那曲唑在未處理(A)、酸(B)、堿(C)、氧化(D)、高溫(E)、光照(F)條件下的HPLC圖譜

3 討論

本研究對(duì)2015版藥典中阿那曲唑的有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)過摸索，將原有的乙腈-水(45:55，v/v)調(diào)整為乙腈-水(42:58，v/v)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在該比例下，分離效果更好，峰形也更優(yōu)。

陰道環(huán)制劑中，藥物均勻分散在硅橡膠輔料中，將藥物從硅橡膠中徹底提取存在一定困難，因此對(duì)藥物的提取方法也進(jìn)行了優(yōu)化，考察了超聲法、磁力攪拌法及兩者結(jié)合法，篩選了甲醇、乙腈兩種提取溶劑，考察了不同的提取溶劑體積，最終選擇室溫下，100 ml甲醇，磁力攪拌提取24 h作為藥物的提取方法，此方法最為經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、方便。

采用了不加校正因子的主成分自身對(duì)照法對(duì)阿那曲唑陰道環(huán)中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明輔料完全不干擾主藥的測(cè)定；有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果表明單雜質(zhì)和總雜質(zhì)含量均低于0.5%，也不會(huì)對(duì)主藥的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾。

本研究考察了提取方法，優(yōu)化了流動(dòng)相比例，將HPLC法應(yīng)用于阿那曲唑陰道環(huán)的有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，此法的專屬性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好，符合相關(guān)規(guī)定的要求，可以為阿那曲唑陰道環(huán)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供科學(xué)依據(jù)。