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    固相支持液-液萃取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人全血中環(huán)孢素A

    2018-11-21 08:52:18賈葉青張倩影張愛國王曼曼李冬梅王學(xué)生
    分析測試學(xué)報 2018年11期
    關(guān)鍵詞:丁基全血標(biāo)準(zhǔn)溶液

    利 利,賈葉青,張倩影,張愛國,王曼曼,李冬梅,3*,王學(xué)生*

    (1.華北理工大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,河北 唐山 063210;2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院,河北 唐山 063000;3.華北理工大學(xué) 藥學(xué)院,河北 唐山 063210)

    環(huán)孢素A(Cyclosporin A,CsA,圖1)是一種強效、高選擇性的免疫抑制劑,臨床上用于治療肝、腎等器官移植的排斥反應(yīng)和其他自身免疫性疾病,但存在治療窗窄、副作用多、口服生物利用度不穩(wěn)定、個體間及個體內(nèi)的藥代動力學(xué)差異大等問題[1]。在臨床應(yīng)用中,腎臟和心臟移植患者的CsA安全用藥濃度范圍為100~200 ng/mL,肝臟移植患者為100~400 ng/mL[2]。因此,在患者治療過程中,為提高CsA免疫抑制作用,減少其毒性作用,準(zhǔn)確監(jiān)測CsA的血藥濃度具有重要的臨床意義。

    圖1 環(huán)孢素A和環(huán)孢素D的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of CsA and CsD

    目前,CsA血藥濃度分析方法主要包括光譜法、色譜法和免疫法等,其中色譜法為常用方法[3-6]。由于血液成分復(fù)雜,所含雜質(zhì)干擾測定,且血液中待測組分含量較低,難以檢出,因此在儀器分析前需對樣品中的待測物進行富集和凈化。目前,生物樣品中CsA的前處理方法主要有液-液萃取法(LLE)[7-9]和固相萃取法(SPE)[10],但LLE法溶劑使用量大、耗時,不適用于高通量分析檢測;SPE法通常需活化、上樣、淋洗和洗脫,步驟較多,易出現(xiàn)操作誤差和污染。因此,建立簡單、快速測定血液樣品中CsA的方法具有重要的研究意義和實際價值。

    固相支持液-液萃取(Solid supported liquid-liquid extraction,SLE)法作為一種新型前處理方法,是在傳統(tǒng)液-液萃取法的基礎(chǔ)上,采用硅藻土為吸附劑,利用其吸水性強、性質(zhì)穩(wěn)定的特點,快速吸附樣品基質(zhì)中的水分,在吸附劑表面形成液膜,從而使目標(biāo)物與水相分離,實現(xiàn)對目標(biāo)物的富集與凈化。SLE不僅避免了活化和淋洗步驟,操作簡單,且具有不易產(chǎn)生乳化、基質(zhì)效應(yīng)低和樣品用量少等優(yōu)點[11]。Yoshikawa等[12]利用SLE前處理結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析,建立了雞肉中多種獸藥殘留的分析方法;Gao等[13]發(fā)展了一種SLE結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定人尿中阿米他唑、殺螨甲菊酯、甲胎菊酯及其主要代謝物的方法。SLE方法已成功應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和環(huán)境等[12-16]樣品的前處理。

    本研究采用SLE對全血樣品中CsA進行凈化和萃取,結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS),以環(huán)孢素D(Cyclosporin D,CsD,圖1)為內(nèi)標(biāo)物進行定量,建立了人全血中CsA的準(zhǔn)確定量分析方法,可為臨床CsA血藥濃度監(jiān)測提供新的技術(shù)支持。

    1 實驗部分

    1.1 儀器與試劑

    LCMS-8040液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本島津公司):液相色譜包括CBM-20A控制器、LC-30AD泵、DGU-20A5R脫氣系統(tǒng)、SIL-30AC自動進樣器和CTO-20AC柱溫箱;質(zhì)譜為三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,電噴霧電離源,軟件控制系統(tǒng)為LabSolutions LCMS Ver.5.53。ET-3301A型氮氣濃縮儀(天津恒奧科技發(fā)展有限公司);Sigma 3K-15型離心機(上海精宏實驗設(shè)備公司);Milli-Q水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

    甲醇、乙腈(色譜純,美國Sigma-Aldrich公司);正己烷(n-Hex,99.5%)、二氯甲烷(DCM,99.8%)、甲基叔丁基醚(MTBE,99.7%)均購自北京迪馬科技有限公司;乙酸乙酯(EA,99.0%,上海阿拉丁試劑公司);石油醚(PE,天津富宇精細(xì)化工有限公司);SLE柱(1 mL)購自上海拜泰齊貿(mào)易有限公司。

    標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)CsA(99.0%,Toronto Research Chemicals公司(加拿大)),CsD(99.0%,上海同田生物技術(shù)股份有限公司)。使用甲醇分別配制1 g/L的CsA和CsD標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,4 ℃下避光儲存。

    1.2 樣品制備

    收集河北省某醫(yī)院10例骨髓移植術(shù)后患者的全血樣品,于-80 ℃下冷凍保存,使用前自然解凍至室溫。本試驗經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

    取全血樣品200 μL置于1.5 mL離心管中,加入200 μL硫酸鋅溶液(0.1 mol/L)渦旋1 min后,2 500 g離心4 min,轉(zhuǎn)移上清液(約120 μL),用甲醇-水(體積比5∶95)定容至0.8 mL待用。

    1.3 SLE方法

    將0.8 mL樣品上樣至SLE柱,靜置10 min,使樣品溶液充分浸潤并均勻分布在吸附劑表面,用7 mL甲基叔丁基醚對分析物進行洗脫。收集洗脫液,25 ℃氮吹至干,用甲醇定容至200 μL。

    1.4 LC-MS/MS條件

    色譜條件:Shim-pack XR-ODS色譜柱(75 mm×3.0 mm i.d.,2.2 μm,日本島津公司);流動相為乙腈-水(體積比95∶5);流速為0.3 mL/min;進樣量為10 μL;柱溫60 ℃。

    質(zhì)譜條件:電噴霧電離源,正離子模式ESI(+);掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;霧化氣流速:3 L/min;干燥氣流速:15 L/min;離子源溫度:300 ℃;加熱塊溫度:450 ℃;碰撞氣電壓:230 kPa。CsA及其內(nèi)標(biāo)物CsD的保留時間分別為2.1、2.5 min,質(zhì)譜分析參數(shù)離子對(m/z)分別為1 219.8/1 202.7、1 233.8/1 216.6,碰撞能量(eV)分別為17、28。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 SLE萃取條件的考察

    SLE進行樣品前處理時,無需活化和淋洗步驟,水溶液樣品直接上樣,完全吸附后,利用有機溶劑洗脫,即可達到快速萃取和凈化的目的,因此洗脫溶劑的選擇決定了SLE的準(zhǔn)確度。另外,洗脫后需對樣品進行氮吹濃縮。因此,本實驗對氮吹蒸發(fā)壓力、洗脫溶劑種類及體積進行優(yōu)化,實驗平行進行3次。

    2.1.1氮吹蒸發(fā)壓力在25 ℃條件下,考察了氮吹蒸發(fā)壓力(21~55 kPa)對5 mg/L CsA標(biāo)準(zhǔn)溶液回收率的影響(圖2A)。結(jié)果顯示,氮吹蒸發(fā)壓力為28 kPa時CsA的回收率最高,因此最終選擇氮吹蒸發(fā)壓力為28 kPa。

    2.1.2洗脫溶劑種類SLE的洗脫溶劑應(yīng)與水不混溶,且對CsA有良好的溶解性。在CsA上樣質(zhì)量濃度為5 mg/L,上樣體積為0.8 mL,洗脫溶劑體積為7 mL的條件下,分別考察了正己烷、石油醚、乙酸乙酯和甲基叔丁基醚作為洗脫溶劑時CsA的回收率(圖2B)。結(jié)果表明,甲基叔丁基醚對目標(biāo)物的回收率最高,故采用甲基叔丁基醚作為SLE的洗脫溶劑。

    2.1.3洗脫溶劑體積在CsA上樣質(zhì)量濃度為5 mg/L,上樣體積0.8 mL的條件下,考察了甲基叔丁基醚體積(5、6、7、8 mL)對CsA回收率的影響(圖2C)。結(jié)果顯示,當(dāng)甲基叔丁基醚用量為7 mL時CsA的回收率最高,用量為8 mL時回收率反而降低,可能是由于氮吹時間延長導(dǎo)致了CsA損失。因此,實驗選擇甲基叔丁基醚的體積為7 mL。

    圖3 空白血樣加標(biāo)(A)和標(biāo)準(zhǔn)溶液(B)的MRM譜圖Fig.3 MRM chromatograms of spiked samples of whole blood(A) and standard solution(B)CsA:100 μg/L;CsD:200 μg/L

    2.2 線性關(guān)系、檢出限及定量下限

    采用“1.4”條件對0、1.5、5、15、50、150、500 μg/L的CsA和200 μg/L CsD內(nèi)標(biāo)物溶液(n=3)進行分析,測定目標(biāo)物峰面積,以CsA與CsD峰面積的比值(y)為縱坐標(biāo),CsA的質(zhì)量濃度(x,μg/L)為橫坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果顯示,CsA在1.5~500 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,線性方程為y=0.004 6x+0.003,相關(guān)系數(shù)(r)為0.998,檢出限(LOD,S/N=3)為0.5 μg/L,定量下限(LOQ,S/N=10)為1.5 μg/L。

    2.3 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

    以空白全血加標(biāo)樣品進行回收率和精密度實驗,分別添加50、100、400 μg/L 3個水平的CsA標(biāo)準(zhǔn)溶液和200 μg/L的CsD標(biāo)準(zhǔn)溶液,每組平行實驗3次。CsA的平均加標(biāo)回收率為78.6%~83.5%,日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.1%~5.6%和4.5%~8.3%。圖3為空白血樣加標(biāo)和標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM譜圖,由圖可見,在最優(yōu)條件下,將加標(biāo)100 μg/L CsA和200 μg/L CsD的健康人全血經(jīng)SLE萃取后,目標(biāo)物在出峰位置無明顯基質(zhì)干擾,特異性良好。表明本方法能夠有效凈化和萃取全血基質(zhì)中的CsA。

    2.4 實際樣品分析

    在最優(yōu)實驗條件下,使用SLE結(jié)合LC-MS/MS測定10例骨髓移植術(shù)后患者全血樣品中CsA的濃度。結(jié)果顯示10例樣品的CsA質(zhì)量濃度為100~400 μg/L,均在安全血藥濃度范圍內(nèi)。分別向?qū)嶋H樣品添加100 μg/L的CsA標(biāo)準(zhǔn)溶液和200 μg/L的CsD標(biāo)準(zhǔn)溶液,每組平行實驗3次,計算得10例骨髓移植術(shù)后患者的平均加標(biāo)回收率為79.5%±2.1%。

    2.5 方法比較

    為進一步說明所建方法的可行性,將本方法與文獻方法進行對比(表1)。與血樣中CsA的常用前處理方法LLE、SPE法相比,本方法的回收率與文獻方法相當(dāng),但靈敏度更高,且避免了活化和淋洗步驟,溶劑用量少,操作簡單。

    表1 本方法與文獻方法的分析結(jié)果對比Table 1 Comparison of the present method with the reported methods for determination of CsA in the whole blood samples

    3 結(jié) 論

    本研究建立了基于SLE前處理技術(shù)結(jié)合LC-MS/MS測定全血中CsA的分析方法,該法簡便快速,靈敏度和準(zhǔn)確度良好,可為臨床CsA血藥濃度監(jiān)測提供技術(shù)支持和個性化用藥依據(jù),有助于更加準(zhǔn)確指導(dǎo)臨床進行劑量調(diào)整,優(yōu)化藥物治療方案。

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