靜脈注射Ghrelin聯(lián)合不同劑量瑞舒伐他汀對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化兔CTRP3和CTRP9的影響

李建權(quán)，林海霞，劉巨鵬，烏云，劉國(guó)棟，李盼

（1.內(nèi)蒙古包頭市包鋼集團(tuán)第三職工醫(yī)院心血管內(nèi)科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.內(nèi)蒙古包頭市包鋼集團(tuán)第三職工醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；3.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

動(dòng)脈粥樣硬化已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的主要因素，并呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)。建立動(dòng)脈硬化動(dòng)物模型，進(jìn)行相關(guān)研究顯得十分必要。近年研究表明，Ghrelin通過(guò)延緩動(dòng)脈粥樣硬化、改善急性心肌梗死預(yù)后、抑制心室重構(gòu)及改善心功能等作用在冠心病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中發(fā)揮著積極的作用。補(bǔ)體C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白（C1q tumor necrosis factor related protein,CTRP）家族因子CTRP3、CTRP9也是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，對(duì)延緩動(dòng)脈粥樣硬化及心血管系統(tǒng)的保護(hù)有明顯意義。本研究在兔動(dòng)脈粥樣硬化模型的基礎(chǔ)上給予Ghrelin聯(lián)合不同劑量瑞舒伐他汀治療，觀察動(dòng)脈硬化相關(guān)指標(biāo)的變化，具有臨床指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 觀察對(duì)象 20只健康家兔來(lái)自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，二月齡，雄性，體質(zhì)量（1.26±0.31）kg。

1.2 材料與設(shè)備 高脂飼料：膽固醇1%＋蛋黃5%＋豬油5%＋普通飼料89%，140 g/d，12周；瑞舒伐他汀（美國(guó)阿斯利康制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：H20160116），Ghrelin（美國(guó)Biovision公司），CTRP3、CTRP9檢測(cè)試劑盒[武漢奧美生物工程有限公司（人源性）]采用ELisa法測(cè)定（雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）；彩色多普勒：Pillip Q7,采用13 MHz高頻線陣探頭。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 造模實(shí)驗(yàn)[1]20只兔，給予高脂飲食12周，在其前后分別行指標(biāo)測(cè)定。

1.3.2 分組及治療 兔動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型造模[1]成功后，隨機(jī)分為3組，開(kāi)始治療實(shí)驗(yàn)，治療期間恢復(fù)正常飼料，自由攝食水；20只隨機(jī)分組，方案如下。

表1 實(shí)驗(yàn)分組與治療方案

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定 在造模前后及治療前后分別進(jìn)行如下指標(biāo)測(cè)定[1]：①超聲測(cè)定實(shí)驗(yàn)兔頸總動(dòng)脈血流阻力指數(shù)（RI）及血流搏動(dòng)指數(shù)（PI）；②血液生化指標(biāo)：TC、HDL-C、LDL-C、Hcy、CTRP3、CTRP9。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模前后測(cè)定指標(biāo) 造模前后指標(biāo)比較，除了CTRP9外，生化指標(biāo)TC、HDL-C/LDL-C、Hcy、CTRP3以及RI、PI均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 造模前后指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.2 治療前后測(cè)定指標(biāo) 其中，ASL與ASH兩組治療前各項(xiàng)指標(biāo)分別與ASC組治療前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性；經(jīng)過(guò)4周的不同劑量瑞舒伐他汀聯(lián)合Ghrelin治療觀察，具體結(jié)果，見(jiàn)表3。注：每一組內(nèi)治療前后比較：aP＜0.05，aaP＜0.05；每一組治療后與ASC組治療后比較：bP＜0.05

表3 各組治療前后指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

3 討論

本課題首先建立了兔動(dòng)脈粥樣硬化模型[1]，經(jīng)過(guò)12周的高脂飲食喂養(yǎng)，通過(guò)對(duì)血脂指標(biāo)檢測(cè)及應(yīng)用彩色多普勒檢測(cè)指標(biāo)--血流阻力指數(shù)和搏動(dòng)指數(shù)檢測(cè)血管功能，結(jié)果顯示，本研究應(yīng)用的造模方法可以形成滿意的兔動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型。

補(bǔ)體C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白（CTRP），是由與脂聯(lián)素結(jié)構(gòu)類似的一組蛋白組成[2]。近年來(lái)對(duì)其家族成員CTRP3和CTRP9的生物學(xué)作用成為研究熱點(diǎn)。CTRP3可引起血管明顯舒張。Akiyama等[3]發(fā)現(xiàn)，CTRP3對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有促增殖、遷移作用，促增殖作用能被絲裂原活化蛋白激酶激酶1（MEK1/2）抑制劑和p38 MAPK抑制劑抑制，而促遷移作用僅能被ERK1/2抑制劑阻斷，表明該信號(hào)通路在CTRP3促內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，外周血中CTRP3水平與多種心臟代謝指標(biāo)，如：TG、HDL-C、GFRH、Hs-CRP和主動(dòng)脈脈搏波傳導(dǎo)速度具有相關(guān)性[4]。此外，單核細(xì)胞分泌的CTRP3可抑制MCP-1分泌，同時(shí)增加脂聯(lián)素分泌[5]。上述研究表明了CTRP3對(duì)于炎癥反應(yīng)具有抑制效應(yīng)，在動(dòng)脈粥樣硬化中可能具有保護(hù)性作用。研究發(fā)現(xiàn)，CTRP9與新生血管內(nèi)膜形成密切有關(guān)。在股動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫的小鼠模型中，CTRP9顯著抑制了新生內(nèi)膜厚度和平滑肌細(xì)胞增殖[6]。CTRP9通過(guò)激活環(huán)磷酸腺苷（cAMP）-激酶A（PKA）通路來(lái)阻斷PDGF-BB誘導(dǎo)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）激活及細(xì)胞增殖和遷移。同時(shí)，CTRP9具有明顯的舒張血管作用，其作用依賴于內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO，通過(guò)AMPK/Akt/eNOS/NO釋放增加是其發(fā)揮舒血管作用的重要分子機(jī)制[7-8]。本研究應(yīng)用瑞舒伐他汀聯(lián)合Ghrelin做為治療方案，CTRP3具有顯著性差異，而CTRP9無(wú)明顯變化，也提示了干預(yù)行為及藥物機(jī)理與二個(gè)因子的生物學(xué)作用密切相關(guān)。

Ghrelin[9]發(fā)現(xiàn)于1999年，是從大鼠胃黏膜中分離出來(lái)的具有促生長(zhǎng)激素釋放作用的小分子多肽，在人類動(dòng)脈、靜脈、血管平滑肌細(xì)胞及心肌細(xì)胞都有表達(dá)[10-11]；Iantorno等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin可通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路，激活內(nèi)皮細(xì)胞NO合酶，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞NO合成，以舒張血管保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。另外，Ghrelin也能通過(guò)降低活性氧(ROS)的產(chǎn)生和激活PI3K／Akt信號(hào)途徑抑制高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304凋亡[13]，可抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[14]。Ghrelin可抑制巨噬細(xì)胞對(duì)血漿LDL-C的吞噬，減少泡沫細(xì)胞的產(chǎn)生，從而減少脂質(zhì)斑塊形成[15]。研究表明Ghrelin可能通過(guò)上調(diào)HDL-C／LDLC比值，抑制泡沫細(xì)胞的形成[16]。Ghrelin可與其靶受體GSHR結(jié)合抑制多種炎癥因子的釋放，延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[17]。他汀類藥物具有改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、穩(wěn)定斑塊，抑制泡沫細(xì)胞形成、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，抗動(dòng)脈粥樣硬化、降低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等作用[18]。其中，瑞舒伐他汀是目前降LDL-C較強(qiáng)的他汀類藥物，能有效降低低密度脂蛋白，降低膽固醇[19-20]。

我們經(jīng)過(guò)對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化模型給予Ghrelin聯(lián)合瑞舒伐他汀治療，在ASC組，對(duì)于兔的動(dòng)脈粥樣硬化模型，經(jīng)過(guò)12周的正常飲食，TC和LDL-C均有下降，有顯著性差異，說(shuō)明家兔對(duì)于高脂血癥的存在具有自我調(diào)控能力，但是HDL-C未見(jiàn)明顯變化，可能有多方面的影響因素；將三個(gè)組的治療后數(shù)據(jù)進(jìn)行了組間比較，具有顯著性差異，說(shuō)明Ghrelin聯(lián)合瑞舒伐他汀的應(yīng)用確有療效。

結(jié)果顯示，RI及PI均有改善，其中高劑量組具有極顯著差異；血脂指標(biāo)也有顯著改善，有助于動(dòng)脈粥樣硬化的延緩，有助于減輕斑塊的形成；經(jīng)過(guò)二種藥物的治療，CTRP3水平變化顯著，可能與脂質(zhì)代謝及動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程有著更密切的關(guān)系；而CTRP9對(duì)于二種藥物的治療未顯示出顯著性差異，也許與其生物學(xué)特性相關(guān)，CTRP9與缺血心肌及新生血管有更密切的關(guān)系[6]，不除外劑量及療程的不足，有待進(jìn)一步研究。本研究同時(shí)觀察了Hcy的變化，隨著動(dòng)脈粥樣硬化模型的形成，Hcy顯著升高，治療實(shí)驗(yàn)中并未給予葉酸治療，但其也有降低趨勢(shì)，說(shuō)明Hcy與代謝綜合征的發(fā)生發(fā)展有著密切的內(nèi)在的聯(lián)系。我們未能觀察Ghrelin和瑞舒伐他汀單獨(dú)治療的作用及結(jié)果，有待于進(jìn)一步的研究。

本研究通過(guò)應(yīng)用Ghrelin和不同劑量瑞舒伐他汀對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化兔的治療，檢測(cè)血清中CTRP3、CTRP9的表達(dá)變化及血管功能的改善，闡明靜脈注射Ghrelin和不同劑量瑞舒伐他汀聯(lián)合使用對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化的影響，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供重要的理論依據(jù)，具有臨床指導(dǎo)意義。