大鼠斑蝥酊天灸發(fā)泡的影響因素探討

肖雙凱,張江松,焦俊玥,趙逸彬,林咸明

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大鼠斑蝥酊天灸發(fā)泡的影響因素探討

肖雙凱,張江松,焦俊玥,趙逸彬,林咸明

(浙江中醫(yī)藥大學(xué),杭州 310053)

探討大鼠斑蝥酊天灸發(fā)泡的相關(guān)影響因素。采用斑蝥酊刺激大鼠皮膚,觀察并統(tǒng)計(jì)斑蝥酊藥物濃度、藥物劑量、斑蝥酊貼藥時(shí)間、貼藥后是否加壓、是否重復(fù)加藥、大鼠發(fā)泡部位、室溫等方面的差異性。5% 200mL的斑蝥酊貼敷于SD大鼠項(xiàng)部兩耳后脊柱兩旁區(qū)域,并在2 h后重復(fù)給藥200mL 1次, 4 h后可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的天灸發(fā)泡。大鼠天灸穩(wěn)定發(fā)泡的影響因素以人為因素為主,包括藥物濃度、發(fā)泡部位、斑蝥酊貼藥時(shí)間、是否重復(fù)加藥、室溫。控制好人為因素可以提高SD大鼠天灸發(fā)泡模型制備的成功率和穩(wěn)定性。

發(fā)泡療法;灸法;斑蝥酊;大鼠

天灸是采用刺激性較強(qiáng)的中藥貼敷在皮膚特定穴位,使局部發(fā)熱、充血、發(fā)紅、發(fā)泡甚至化膿的一種外治方法[1]。目前,國內(nèi)外關(guān)于天灸的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均因缺乏穩(wěn)定的大鼠天灸發(fā)泡模型而受到限制。斑蝥是天灸臨床和實(shí)驗(yàn)中常用的發(fā)泡藥物,相對于傳統(tǒng)的白芥子發(fā)泡具有一定的優(yōu)勢[2]。筆者通過對斑蝥劑型的改良,不斷嘗試,終于探索出了一種穩(wěn)定的大鼠天灸發(fā)泡方法。同時(shí),筆者經(jīng)過前期大量預(yù)實(shí)驗(yàn)和查閱文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)影響大鼠斑蝥酊天灸發(fā)泡的因素主要以人為因素為主,包括斑蝥酊藥物濃度、藥物劑量、貼藥時(shí)間、是否重復(fù)加藥、發(fā)泡部位及室溫等。為了提高該模型制備的成功率和穩(wěn)定性,本文從這些方面進(jìn)行展開,以期為天灸的實(shí)驗(yàn)研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與預(yù)處理

選用健康雄性清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠,體重為(250±10)g,購自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號SCXK浙2014-0001),由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及自由飲水。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》[3]中相關(guān)規(guī)定。

實(shí)驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行大鼠發(fā)泡區(qū)域的備皮。大鼠腹腔麻醉后,于項(xiàng)部兩耳后脊柱兩旁(相當(dāng)于大椎穴處)等距離、等面積用薇婷脫毛膏脫毛4 cm2,用生理鹽水清潔,室溫控制在26℃,大鼠于恒溫臺上安置。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與藥物

斑蝥粉(華東醫(yī)藥公司,批號100722);95%乙醇(上海展云化工有限公司,批號20140412);5 cm×5 cm內(nèi)圈1 cm新型PU防水空白膏藥貼(連云港三瑞醫(yī)療器械制造有限公司);PU防水膜(連云港三瑞醫(yī)療器械制造有限公司);薇婷脫毛膏(利潔時(shí)家化有限公司)。

1.3 斑蝥酊的配制及發(fā)泡藥貼的準(zhǔn)備

1.3.1 斑蝥酊的配制

分別用5 g、10 g、20 g、30 g的生藥斑蝥粉浸泡于95%乙醇中,定容至100 mL,1周后過濾而成,放置在4℃冰箱保存,從而得到不同濃度的斑蝥酊,即5%斑蝥酊、10%斑蝥酊、20%斑蝥酊、30%斑蝥酊。

1.3.2 發(fā)泡藥貼的準(zhǔn)備

稱取0.018 g棉球填充于PU防水空白膏藥貼的中央,輕輕按壓,以棉球剛好填充滿并且不高突于發(fā)泡藥貼的中心圈為度。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 天灸發(fā)泡方法

上述準(zhǔn)備工作完成后,用移液槍吸取200mL斑蝥酊均勻浸濕發(fā)泡藥貼中心棉球后,貼敷于大鼠待發(fā)泡區(qū)域。發(fā)泡藥貼四周貼膜應(yīng)當(dāng)均勻,防止藥物揮發(fā)。2 h后加200mL斑蝥酊1次,用PU防水膜密封覆蓋,每隔1 h觀察并記錄1次。待泡體大小不再繼續(xù)增加,立即收集泡液。從中間區(qū)域剪下PU防水膜,鑷子夾出棉球并沿著發(fā)泡藥貼的內(nèi)側(cè)緣提起,觀察發(fā)泡情況。大鼠于恒溫臺上安置,待蘇醒后單籠飼養(yǎng),每日觀察1～2次。

1.4.2 相關(guān)影響因素

1.4.2.1 不同斑蝥酊藥物濃度

32只雄性SD大鼠麻醉、脫毛后,吸取200mL 4種濃度(5%斑蝥酊、10%斑蝥酊、20%斑蝥酊、30%斑蝥酊)的斑蝥酊均勻浸濕發(fā)泡藥貼中央棉球后,貼敷刺激。2 h后各加200mL相應(yīng)濃度的斑蝥酊1次,密封覆蓋,4 h后統(tǒng)一收集泡液。觀察各組發(fā)泡率和泡體大小情況,從而篩選出影響發(fā)泡率的最佳斑蝥酊濃度。同時(shí),每隔1 h觀察發(fā)泡情況,并詳細(xì)記錄,以明確不同貼藥時(shí)間對發(fā)泡的影響。其他條件均控制相同。

1.4.2.2 藥物劑量

48只雄性SD大鼠麻醉、脫毛后,按照上述濃度隨機(jī)分為4組(5%斑蝥酊、10%斑蝥酊、20%斑蝥酊、30%斑蝥酊),每組12只。每組按照不同劑量又分為3組,即低劑量(50mL)4只、中等劑量(100mL)4只和最大劑量(200mL)4只。分別吸取不同劑量、不同濃度的斑蝥酊均勻浸濕發(fā)泡藥貼中央棉球后,貼敷刺激。其他方法同上,2 h后同樣各加相應(yīng)劑量、相應(yīng)濃度的斑蝥酊1次,觀察各組發(fā)泡率情況,從而篩選出影響發(fā)泡的最佳斑蝥酊劑量。其他條件均控制相同。

1.4.2.3 重復(fù)給藥

選用16只雄性SD大鼠,分為單次給藥組與重復(fù)給藥組,每組8只。單次給藥組只在初次給予5%斑蝥酊刺激,后續(xù)不重復(fù)給藥;重復(fù)給藥組在初次給予5%斑蝥酊刺激后的2 h,重復(fù)給藥1次。觀察重復(fù)給藥與否對于斑蝥酊天灸發(fā)泡的影響。其他條件均控制相同。

1.4.3 貼藥時(shí)間

據(jù)上述方法篩選出斑蝥酊最佳濃度和劑量之后,以此觀察不同貼藥時(shí)間組(2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h)大鼠發(fā)泡泡體大小的變化,每組8只,從而選出最佳收取泡液的時(shí)間點(diǎn)。

1.4.4 發(fā)泡部位

選取15只SD大鼠,分為3組,分別取背部3處部位發(fā)泡,即大椎穴處、背部正中線處和背部中線兩側(cè)0.5 cm處,每組5只。發(fā)泡方法同上所述,2 h后需重復(fù)給藥1次。大鼠大椎穴定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[4]中大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜定位及部分相關(guān)文獻(xiàn)[5]。其他條件均控制相同。觀察不同部位對大鼠天灸發(fā)泡的影響。

1.4.5 室溫

選取15只SD大鼠,分別在不同室溫條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d,然后進(jìn)行天灸發(fā)泡,分為根據(jù)不同室溫[較低溫度(16℃)、適宜溫度(26℃)和高溫(36℃)]分為3組,每組5只。其他條件均控制相同。觀察不同室溫環(huán)境對大鼠天灸發(fā)泡的影響。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較時(shí),若方差齊采用單因素方差分析()-檢驗(yàn),方差不齊則用’-檢驗(yàn);組內(nèi)前后比較采用重復(fù)測量資料的方差分析。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

因大鼠和人皮膚的差異性,目前尚無詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)性大鼠天灸發(fā)泡的文獻(xiàn)報(bào)道,筆者經(jīng)過多次反復(fù)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)泡體大小尚無法人為控制,最小可如粟米般,最大者可充滿整個(gè)發(fā)泡藥貼,泡體大小暫無明確的分類標(biāo)準(zhǔn),需要進(jìn)一步大樣本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證、歸類。故筆者暫擬以出現(xiàn)泡體即可作為發(fā)泡成功的標(biāo)準(zhǔn)。

2.1 不同斑蝥酊藥物濃度對發(fā)泡率以及泡體大小的影響

各組大鼠都有不同程度的發(fā)泡,低濃度組(5%斑蝥酊組和10%斑蝥酊組)發(fā)泡率整體高于高濃度組(20%斑蝥酊組和30%斑蝥酊組);低濃度組中5%斑蝥酊發(fā)泡率為87.5%,高于10%斑蝥酊組的75.0%;高濃度組中,20%斑蝥酊組發(fā)泡率和30%斑蝥酊組相同,均為62.5%。低濃度組發(fā)泡率高于高濃度組,尤其以5%斑蝥酊組成功發(fā)泡數(shù)最多,發(fā)泡率最高。提示斑蝥酊濃度因素對發(fā)泡有一定的影響,但不是決定性因素。實(shí)驗(yàn)觀察到高濃度組極易出現(xiàn)燙傷樣疤痕,大鼠一般情況較差,低濃度組為更適合斑蝥酊天灸的濃度選擇。詳見表1。

表1 各組大鼠發(fā)泡率及泡體大小比較

2.2 藥物劑量對發(fā)泡的影響

本研究所選用的PU防水空白膏藥貼中心棉團(tuán)的最大載藥量為200mL,若繼續(xù)加大給藥量,則發(fā)泡區(qū)域會(huì)全部被藥物浸濕,四周也會(huì)滲透蔓延,直接影響到發(fā)泡效果,對大鼠刺激性太強(qiáng),故把200mL定義為最大斑蝥酊劑量。其次,設(shè)定梯度濃度,最小給藥劑量為 50mL,此時(shí)中心棉團(tuán)只有小部分浸濕;中等給藥劑量為100mL,此時(shí)中心棉團(tuán)大部分區(qū)域均浸濕,但并不充分。筆者發(fā)現(xiàn)不同斑蝥酊劑量對大鼠發(fā)泡有明顯影響,突出表現(xiàn)在各組給藥50mL時(shí)均不發(fā)泡;給藥100mL時(shí),低濃度組(5%斑蝥酊組和10%斑蝥酊組)偶見少量發(fā)泡;給藥200mL時(shí),低濃度組發(fā)泡普遍,均高于高濃度組。并且在低濃度組中,5%斑蝥酊組發(fā)泡效果始終高于10%斑蝥酊組,故筆者認(rèn)為5% 200mL斑蝥酊是最適宜發(fā)泡的濃度和劑量,同時(shí)也觀察到結(jié)痂和劑量有直接關(guān)系,而與濃度關(guān)系不大,給藥200mL的各組均出現(xiàn)不同程度的結(jié)痂,但是給藥50mL和100mL各組均無結(jié)痂出現(xiàn)。詳見表2。

表2 各組同一部位不同斑蝥酊劑量發(fā)泡率比較 (只)

2.3 斑蝥酊貼藥時(shí)間對發(fā)泡的影響

在篩選出5% 200mL斑蝥酊后,筆者以此濃度和劑量觀察不同貼藥時(shí)間對發(fā)泡的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)天灸1～2 h時(shí),各組大鼠均無發(fā)泡。天灸3 h后,逐漸有少量大鼠天灸區(qū)域起泡。4 h是一個(gè)很重要的時(shí)間節(jié)點(diǎn),天灸4 h前,大鼠只有少部分發(fā)泡或不發(fā)泡;天灸4 h后,大鼠普遍有發(fā)泡,且隨時(shí)間的增加,發(fā)泡泡體不會(huì)繼續(xù)增大。部分大鼠在原有泡體周圍,還有1～2處新增泡體出現(xiàn)。天灸24 h前后,泡液幾乎完全消失。故本研究以4 h作為統(tǒng)一收集泡液的時(shí)間點(diǎn)。詳見表3。

2.4 是否重復(fù)給藥對發(fā)泡的影響

對于重復(fù)加藥方法的確定,本研究發(fā)現(xiàn)單純1次給于200mL的5%斑蝥酊并不能發(fā)泡,這可能是由于斑蝥酊經(jīng)過皮膚滲透逐漸吸收之后,發(fā)泡藥貼中心棉團(tuán)逐漸干燥,剩余斑蝥酊劑量不足,不能起到持續(xù)性的皮膚表面刺激。故本研究經(jīng)過進(jìn)一步嘗試,在天灸2 h時(shí)加藥1次,保證了持續(xù)性的藥物刺激,最終獲得了穩(wěn)定的發(fā)泡。本研究還發(fā)現(xiàn),在首次貼藥刺激2 h后只用加斑蝥酊1次即可穩(wěn)定發(fā)泡,不需要加藥多次。多次加藥對大鼠皮膚有直接的損傷,會(huì)造成大鼠皮膚發(fā)紅、潰爛,同時(shí)大鼠會(huì)出現(xiàn)明顯的狂躁多動(dòng)等不良情況。詳見表4。

表3 天灸不同時(shí)間大鼠發(fā)泡及泡體大小比較

表4 不同給藥次數(shù)大鼠發(fā)泡率比較 (只)

2.5 不同部位發(fā)泡的差異性

通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn),筆者發(fā)現(xiàn)大鼠背部可以實(shí)現(xiàn)發(fā)泡,而腹部不發(fā)泡。本研究在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上又發(fā)現(xiàn)大鼠背部尤其以項(xiàng)部兩耳后脊柱兩旁區(qū)域發(fā)泡多見(相當(dāng)于大椎穴處附近),而背部其他區(qū)域很少發(fā)泡或不發(fā)泡。突出表現(xiàn)在大椎穴處發(fā)泡情況良好,發(fā)泡率≥80.0%;背部中線最高點(diǎn)發(fā)泡數(shù)量較少,發(fā)泡率為40.0%;背部中線最高點(diǎn)兩側(cè)0.5cm(相當(dāng)于膀胱經(jīng)處)只有一處發(fā)泡,發(fā)泡率為20.0%。這考慮和大椎穴處附近區(qū)域皮膚薄嫩,表皮層疏松、局部皮膚不易被大鼠抓撓以及不易隨著大鼠的活動(dòng)而受到壓迫和牽拉有關(guān)。故本研究認(rèn)為大椎穴處附近為適合大鼠發(fā)泡的部位。這3處部位也模擬了臨床中大椎穴天灸、督灸以及膀胱經(jīng)穴位天灸,具有一定的臨床依據(jù)。詳見表5。

表5 不同部位、相同斑蝥酊劑量大鼠發(fā)泡率比較 (只)

2.6 不同室溫大鼠天灸發(fā)泡的差異性

表6 不同室溫大鼠發(fā)泡率比較 (只)

通過對3組不同溫度下天灸發(fā)泡情況的觀察統(tǒng)計(jì),筆者發(fā)現(xiàn)溫度對發(fā)泡沒有直接的影響。較低溫度(16℃)的發(fā)泡率較其他兩組稍低,但各組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。詳見表6。

3 討論

目前,國內(nèi)外天灸的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究主要以研究天灸血清為主[6],但是并不發(fā)泡[7],這與動(dòng)物和人類皮膚的差異性、發(fā)泡方法、發(fā)泡藥物和發(fā)泡材料的選擇等諸多因素有關(guān),也在一定程度上限制了天灸的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。筆者發(fā)現(xiàn),天灸發(fā)泡的影響因素包括人為因素和非人為因素。其中,人為因素主要包括藥物濃度、發(fā)泡部位、溫度、貼藥時(shí)間以及是否多次加藥;非人為因素主要包括大鼠周齡、大鼠性別等。通過對以上因素進(jìn)行對比研究,筆者認(rèn)為人為因素在大鼠斑蝥酊天灸發(fā)泡中占主導(dǎo),尤其以藥物濃度、劑量和重復(fù)加藥為主。5% 200mL的斑蝥酊貼敷于大鼠項(xiàng)部兩耳后脊柱兩旁區(qū)域,并在2 h后重復(fù)給藥200mL 1次,4 h后可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定天灸發(fā)泡,這是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在此基礎(chǔ)上,筆者也對室溫、大鼠周齡和大鼠品系等因素進(jìn)行了對比,發(fā)現(xiàn)均無明顯差異性,對大鼠天灸發(fā)泡也均無直接影響。另據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,性別差異可加速炎癥反應(yīng)的消退[8],故本研究統(tǒng)一采用雄性SD大鼠發(fā)泡,這是為了防止雌激素對發(fā)泡的影響。

本實(shí)驗(yàn)中涉及的人為因素相對較多,由于大鼠斑蝥酊天灸發(fā)泡不是單一因素所主導(dǎo),而是由藥物濃度、劑量和重復(fù)加藥這3個(gè)關(guān)鍵因素共同作用的結(jié)果。只控制其中1個(gè)因素,均無法實(shí)現(xiàn)天灸發(fā)泡。故筆者在實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)方面,以其中1個(gè)因素進(jìn)行對比,其他因素保持同時(shí)存在并且條件相同。逐一對這3個(gè)因素進(jìn) 行全面對比后,綜合得出了最終的關(guān)鍵因素。其他次要因素,包括發(fā)泡部位和室溫等,都是在這3個(gè)關(guān)鍵因素完全確立的基礎(chǔ)上進(jìn)行的對比。

同時(shí),筆者另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)觀察了不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)泡區(qū)域皮膚組織病理學(xué)和泡液改變,發(fā)現(xiàn)發(fā)泡伴隨著棘層的肥厚和松解,而且基底層細(xì)胞也有缺失,這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相吻合[9-10]。故筆者認(rèn)為天灸發(fā)泡可能通過影響局部皮膚樹突狀細(xì)胞來發(fā)揮作用。在天灸發(fā)泡液的研究方面,筆者結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[11],認(rèn)為泡液中樹突狀細(xì)胞同樣發(fā)揮著重要作用。樹突狀細(xì)胞在皮膚和泡液中都有分布,筆者認(rèn)為它可能作為天灸后皮膚和泡液免疫炎癥反應(yīng)研究新的結(jié)合點(diǎn),有待于進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

此外,在斑蝥酊的有效藥理成分方面,筆者通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn),用斑蝥素代替斑蝥酊,在大鼠皮膚卻沒有出現(xiàn)發(fā)泡的效果,這可能與人類和大鼠皮膚的差異性有關(guān)。故筆者認(rèn)為很可能是以斑蝥素為主的成分刺激了皮膚而起到發(fā)泡的效果,但并不單純是斑蝥素這單一成分。斑蝥素確有肝腎毒性,經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知,斑蝥酊天灸發(fā)泡是一種以斑蝥素為主要成分的發(fā)泡刺激,它可以對大鼠肝腎造成一定的損傷,可考慮是造模本身對動(dòng)物的不良反應(yīng)[12-15]。但對比上述文獻(xiàn)記載,筆者認(rèn)為無論是參考小鼠或大鼠斑蝥的用量情況,本實(shí)驗(yàn)中所選擇5%的斑蝥酊濃度是在安全劑量以內(nèi),且5%的斑蝥酊不會(huì)造成大鼠死亡,一般情況均良好。本實(shí)驗(yàn)選擇斑蝥作為發(fā)泡刺激源,主要是結(jié)合了臨床上斑蝥的發(fā)泡是在皮膚上形成類似燙傷后透亮的水泡,而白芥子的發(fā)泡是貼敷部位皮膚出現(xiàn)紅腫,高出周圍皮膚,卻無類似燙傷后透亮的水泡。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與斑蝥素、白芥子甙生成的硫代異氰酸對羥芐酯對皮膚刺激作用的層次不同有關(guān)[16-18]。筆者相信,大鼠天灸后穩(wěn)定發(fā)泡的出現(xiàn),會(huì)對天灸泡液成分的研究及其與體液的相關(guān)性研究提供一定的基礎(chǔ),也會(huì)在一定程度上推動(dòng)天灸的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)程。

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Study of the Influencing Factors in the Formation of Blisters in Cantharides Tincture Vesiculation Moxibustion in Rats

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,310053,

To study the influencing factors in the formation of blisters in cantharides tincture vesiculation moxibustion in rats.The skin of rats was stimulated by cantharides tincture. The differences in cantharides tincture concentrations, doses, treatment duration, with or without compression after the application, whether or not a repetitive application, blister area and room temperature were observed and counted.With application of 5% cantharides tincture 200mL to the Sprague-Dawley (SD) rats in the bilateral areas near by the spine and behind the ears, and a repeated application 2 h later at the same dose, stable formation of blisters could be achieved 4 h later.For vesculation moxibustion in rats, human factors are the main factors that influence the stable formation of blisters, including medicine concentrations, blister area, application duration of cantharides tincture, whether or not a repetitive application and room temperature. Good control of human factors can enhance the success rate and the stability of SD rat model of vesiculation moxibustion.

Blistering therapy; Moxibustion; Cantharides tincture; Rats

1005-0957(2018)11-1310-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.11.1310

2018-06-03

“十三五”浙江省中醫(yī)藥(中西醫(yī)結(jié)合)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)計(jì)劃(2017-XK-A18)

肖雙凱(1989—),男,2015級碩士生,Email:379691025@qq.com

林咸明(1966—),男,教授,Email:linxianming66@126.com