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    斑蝥酸鈉對(duì)人食管癌細(xì)胞作用的體外實(shí)驗(yàn)研究

    2014-03-14 08:50:34王桂琦熊朝暉楊光耀馬曉靜
    關(guān)鍵詞:斑蝥酸鈉食管癌

    王桂琦,熊朝暉,杜 萍,王 巖,楊光耀,馬曉靜

    (1.河北省石家莊市第一醫(yī)院外科,河北 石家莊 050011;2.河北省石家莊市第一醫(yī)院麻醉科,河北 石家莊 050011)

    斑蝥素為傳統(tǒng)中藥斑蝥的活性成分,臨床上對(duì)多種腫瘤有效,且具有升高白細(xì)胞而無(wú)骨髓抑制特點(diǎn)[1]。斑蝥酸鈉是斑蝥素的半合成藥物,具有抗多種腫瘤作用,并且具有升高白細(xì)胞、增加機(jī)體免疫力等作用[2-3]。與斑蝥素相比,斑蝥酸鈉的毒性、刺激性明顯減小,尤其明顯減低泌尿系統(tǒng)的不良反應(yīng)。但目前文獻(xiàn)對(duì)于其抗癌機(jī)制報(bào)道較少。本研究以人食管癌Eca109細(xì)胞系為對(duì)象,初步探討斑蝥酸鈉對(duì)食管癌細(xì)胞株生長(zhǎng)的抑制作用及其機(jī)制,旨在為臨床治療食管癌提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要試劑與藥物:RPMI 1640培養(yǎng)液、小牛血清,四甲基偶氮唑藍(lán)(four methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、碘化丙啶(propidium iodide,PI)及Rnase(美國(guó)Sigma公司),斑蝥酸鈉注射液(貴州神奇制藥有限公司)。

    1.1.2 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng):食管癌細(xì)胞株Eca109購(gòu)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所,以含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),置于37℃含5%的CO2孵箱中進(jìn)行生長(zhǎng),待細(xì)胞鋪滿瓶壁70%~80%時(shí),用0.25%胰蛋白酶來(lái)消化貼壁細(xì)胞,選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    1.1.3 細(xì)胞流式儀:美國(guó)Becton Dickinson公司產(chǎn)熒光激活分選儀(FACS-420型)由河北省腫瘤研究所提供。

    1.2 方法

    1.2.1 斑蝥酸鈉對(duì)Eca109細(xì)胞毒性劑量與時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn):Eca109細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增殖期時(shí),調(diào)整細(xì)胞濃度5×108/L,細(xì)胞懸液接種在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。每孔加1mL細(xì)胞懸液與3mL含10%小牛血清的RPMI 1640液,加斑蝥酸鈉,使斑蝥酸鈉終濃度分別為1、4、10、40mg/L,并設(shè)DSMO對(duì)照組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37℃下5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別于12、24、36、48、72h取樣。加入5mg/L MTT 溶液20μL,繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸棄孔內(nèi)上清液,每孔加入 DMSO 150μL,振蕩10min,使結(jié)晶充分溶解,用酶標(biāo)分析儀(490nm波長(zhǎng))測(cè)定每孔光吸收值(OD 值)。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值)×100%。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組光吸收值/對(duì)照組光吸收值×100%。

    1.2.2 斑蝥酸鈉對(duì)Eca109細(xì)胞凋亡劑量與時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞周期測(cè)定:斑蝥酸鈉濃度、作用時(shí)間同上。收集斑蝥酸鈉處理后的細(xì)胞,用不含Ca2+Mg2+的PBS洗,離心800r/min,5min,各2次,以注射器針筒取細(xì)胞沉淀并加上TB針頭,推入4℃預(yù)冷的70%酒精使細(xì)胞均勻分散,細(xì)胞固定20h以上。然后將細(xì)胞離心,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×109/L,取500μL,加PI 50μL(50mg/L碘化物,0.1%檸檬酸鈉,0 1%氚X-100)在室溫下避光染色30min。樣品過(guò)400目網(wǎng)后用流式細(xì)胞儀測(cè)定,顯示凋亡細(xì)胞散點(diǎn)圖;細(xì)胞凋亡時(shí)在G1期左側(cè)出現(xiàn)近2倍體細(xì)胞群峰。同時(shí)用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞G1期、S期及G2+M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)變化。每個(gè)樣品分析1×106個(gè)細(xì)胞×3平行孔。

    2 結(jié) 果

    2.1 斑蝥酸鈉對(duì)Eca109細(xì)胞存活的影響:隨著斑蝥酸鈉作用時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)Eca109細(xì)胞表現(xiàn)出的細(xì)胞不良反應(yīng)亦相應(yīng)增加(P<0.05),隨著藥物濃度的增加Eca109細(xì)胞存活率出現(xiàn)降低(P<0.05)。說(shuō)明斑蝥酸鈉的作用對(duì)時(shí)間、濃度均有依賴(lài)性關(guān)系。見(jiàn)表1。

    組別時(shí)間12h24h36h48h72h0mg/L組96.01±2.6594.65±4.3590.41±3.5464.30±4.8553.90±4.051mg/L組90.29±2.5185.59±3.0181.18±4.52 55.69±5.8145.07±6.444mg/L組86.60±1.3079.64±2.7072.80±3.62 48.46±3.0840.22±4.1810mg/L組81.17±2.9471.58±3.1366.54±5.3541.01±6.7035.20±4.4640mg/L組76.23±3.6062.60±4.9054.07±3.2739.36±5.6826.38±6.91

    2.2 斑蝥酸鈉對(duì)Eca109細(xì)胞凋亡的影響:Eca109細(xì)胞在1、4mg/L斑蝥酸鈉作用后12h即可出現(xiàn)凋亡峰,24h達(dá)高峰;10、 40mg/L斑蝥酸鈉在藥物作用48h才出現(xiàn)明顯的凋亡峰。斑蝥酸鈉在10mg/L濃度時(shí)其誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞凋亡的作用較其他濃度呈現(xiàn)明顯時(shí)間依賴(lài)性關(guān)系。見(jiàn)表2。

    2.3 斑蝥酸鈉對(duì)Eca109細(xì)胞周期的影響:Eca109細(xì)胞經(jīng)不同濃度斑蝥酸鈉作用后處于G2+M期細(xì)胞比例均出現(xiàn)增加,呈現(xiàn)G2+M期阻滯現(xiàn)象(P<0.05)。以40mg/L斑蝥酸鈉作用24、48h尤為明顯。見(jiàn)表3。

    組別時(shí)間12h24h48h0mg/L組8.36±2.368.25±1.957.12±2.241mg/L組26.21±2.5816.82±2.5114.32±3.304mg/L組35.34±2.3628.32±7.1022.06±2.0610mg/L組44.09±2.9061.28±6.4531.25±4.6540mg/L組51.27±3.2579.30±5.2635.41±3.97

    3 討 論

    斑蝥酸鈉是一種廣譜抗癌藥,在以往的報(bào)道中單藥或聯(lián)合化療對(duì)食管癌等惡性腫瘤有一定療效[4],因放療對(duì)于處于G2+M期腫瘤細(xì)胞殺滅作用最強(qiáng),而斑蝥酸鈉能將腫瘤細(xì)胞阻滯于G2+M期,故斑蝥酸鈉聯(lián)合放療能起到“增敏”作用,提高放療治療中晚期腫瘤的療效,并降低放療反應(yīng)。斑蝥為芫青科昆蟲(chóng)南方大斑蝥或黃黑小斑蝥的干燥體,我國(guó)首先發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤的特性[5]。斑蝥主要藥理成分是斑蝥素,隨著近代藥理學(xué)研究的進(jìn)展,已提取、合成了一系列斑蝥酸鈉、甲基斑蝥胺等衍生物,這些衍生物與斑蝥素相比毒性大大降低,而且抗癌作用更明顯[6]。但是,從目前文獻(xiàn)來(lái)看,斑蝥酸鈉誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡及其作用機(jī)制的報(bào)道不多[7]。本研究結(jié)果顯示,斑蝥酸鈉對(duì)Eca109細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用,且存在時(shí)間和劑量效應(yīng)關(guān)系,無(wú)論是低濃度還是高濃度斑蝥酸鈉均可將Eca109細(xì)胞阻滯于G2+M期。1、4、10、40mg/L 4個(gè)濃度斑蝥酸鈉12h均可檢測(cè)到明顯的G2+M期阻滯;24h時(shí)1、4mg/L 2個(gè)濃度的斑蝥酸鈉G2+M期阻滯已消退,而10、40mg/L斑蝥酸鈉G2+M期阻滯作用達(dá)高峰。上述結(jié)果提示低濃度的斑蝥酸鈉處理的細(xì)胞阻斷G2+M期短暫、不完全;而高濃度的斑蝥酸鈉對(duì)Eca109細(xì)胞的G2+M期阻斷作用比低濃度的作用完全且持久,并且隨著濃度增高這種阻斷作用越明顯。在G2+M期阻斷作用過(guò)去后,流式細(xì)胞儀可檢測(cè)到凋亡峰,1、4mg/L斑蝥酸鈉由于其過(guò)早越過(guò)G2+M期,12h即可檢測(cè)到凋亡峰,24h達(dá)高峰;10、40mg/L斑蝥酸鈉在藥物作用后48h才有明顯的凋亡峰,且10mg/L斑蝥酸鈉誘導(dǎo)的凋亡較40mg/L為高。提示低濃度的斑蝥酸鈉可能較高濃度的更易誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,高濃度斑蝥酸鈉更容易導(dǎo)致細(xì)胞壞死。

    斑蝥酸鈉具體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不完全清楚;但目前對(duì)其類(lèi)似物斑蝥素研究較多的是蛋白磷酸酯酶2A(protein phosphatase-2A,PP2A)的抑制劑,同時(shí)也是蛋白磷酸酯酶1(protein phosphatase-1,PP1)的抑制劑[8]。如果PP1的功能被抑制,會(huì)使一種重要的周期蛋白R(shí)b不能去磷酸化,細(xì)胞不能完成由M到G1期的正常轉(zhuǎn)換,會(huì)出現(xiàn)M期阻滯等變化。而PP2A活性被抑制,會(huì)促使細(xì)胞越過(guò)G2進(jìn)入M期“檢查點(diǎn)”,使一些復(fù)制未完成或DNA受損的細(xì)胞也進(jìn)入M期,導(dǎo)致異常的有絲分裂,最終使細(xì)胞發(fā)生凋亡[9]。由此我們推斷,斑蝥酸鈉誘導(dǎo)的Eca109細(xì)胞凋亡的作用可能與使細(xì)胞發(fā)生M期阻滯有關(guān)。

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