BK表達(dá)在雌二醇介導(dǎo)的大鼠結(jié)腸平滑肌收縮中的作用

姜 玲，湯玉蓉，熊文婕，俞 汀，沈小雪，張 靈，林 琳

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科，江蘇 南京 210029

慢性便秘是臨床常見病、多發(fā)病，大量臨床研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，其存在性別差異，通常女性發(fā)病率較男性高，育齡期和妊娠期婦女更易發(fā)病。離體肌條實驗[3]發(fā)現(xiàn)，雌激素可抑制人結(jié)腸平滑肌收縮，機制未明。課題組前期實驗也證實，17β-雌二醇可抑制大鼠結(jié)腸平滑肌收縮[4]。雌激素抑制結(jié)腸平滑肌收縮的確切機制尚不明確。

大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BK)是結(jié)腸平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells, SMCs)胞膜上表達(dá)最高的鉀通道，由α成孔亞基和β1調(diào)節(jié)亞基組成，在維持SMCs胞膜靜息電位、促進細(xì)胞復(fù)極化中起關(guān)鍵的作用[5]。多項研究[6-9]證實，BK的激活/表達(dá)上調(diào)參與血管、氣管、膀胱、子宮等多部位平滑肌的舒張機制。因此，本研究旨在探討雌激素(17β-雌二醇)對大鼠結(jié)腸平滑肌上BK表達(dá)的影響及機制，為治療雌激素相關(guān)性便秘等胃腸動力障礙提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1實驗動物和主要試劑清潔級成年雌性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g；清潔級雌性SD乳鼠，10～12 d齡，由南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號SCXK(蘇)2016-000。17β-雌二醇、牛血清白蛋白(BSA)結(jié)合的17β-雌二醇(BSA-E2)、雌激素受體阻斷劑ICI 182780、雌激素受體α(ERα)選擇性激動劑PPT、雌激素受體β(ERβ)選擇性激動劑DPN、二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)，BKα抗體、BKβ抗體、α-肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(美國Abcam公司)，β-actin抗體(美國CST公司)，DMEM培養(yǎng)液、青霉素-慶大霉素雙抗(美國Hyclone公司)，胎牛血清、Ⅱ型膠原酶(美國Gibco公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗、DAPI、BCA蛋白定量試劑盒(中國碧云天公司)，Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗(美國Bioworld公司)、SuPer ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Thermo公司)，TaKaRa試劑盒(日本TaKaRa公司)。

1.2實驗儀器低溫離心機(美國BECKMAN-COMLTER公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Forma Series Ⅱ)，激光共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司)，酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)，蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，凝膠成像分析系統(tǒng)(GE Healthcare公司)，制冰機BF320 AS(意大利Scotsman公司)。

1.3實驗方法

1.3.1 動物分組及干預(yù)：成年雌性SD大鼠24只，隨機分為以下4組：對照組、E2組、EI組和BSA-E2組。手術(shù)去除雙側(cè)卵巢，14 d后每組成年大鼠背部皮下埋植30 mm硅膠管(內(nèi)徑2 mm，外徑4 mm)，內(nèi)含不同溶劑[10]。對照組：含溶劑玉米油；E2組：含質(zhì)量濃度為0.3 g/L的E2，可使血清E2保持在生理濃度(56～92 pg/ml)[10-11]；EI組：含相同濃度的E2(0.3 g/L)和E2抑制劑(ICI 182780)；BSA-E2組：含質(zhì)量濃度為0.3 g/L的BSA-E2。干預(yù)14 d后處理[12]。

1.3.2 組織免疫熒光檢測大鼠結(jié)腸平滑肌BK分布及表達(dá)：取各組結(jié)腸平滑肌，OCT包埋，制成冰凍切片。質(zhì)量濃度為40 g/L的多聚甲醛固定10 min，組化PBS洗3次，每次10 min。質(zhì)量濃度為100 g/L的山羊血清室溫封閉1 h，滴加BKα/BKβ抗體(兔1∶100)和α-SMA抗體(鼠1∶100)，濕盒中4 ℃過夜。PBS洗3次，每次10 min，避光，加Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶100)和FITC標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(1∶100)，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次，每次15 min，DAPI染核10 min，PBS洗2次，每次10 min，加抗熒光淬滅劑，封片，熒光顯微鏡下觀察特異性熒光。

1.3.3 Western blotting及qRT-PCR檢測結(jié)腸平滑肌BK表達(dá)：各組取少量大鼠結(jié)腸平滑肌組織于1.5 ml EP管中，RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。各孔加入約40 μg蛋白樣品，以恒壓80 V，400 mA行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以恒流300 mA，150 V進行轉(zhuǎn)膜，質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂牛奶封閉2 h，分別加入BKα抗體(兔1∶500)、BKβ抗體(兔1∶500)、β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照、分析。以β-actin為內(nèi)參。

各組取少量大鼠結(jié)腸平滑肌組織，在液氮中迅速研磨成小塊組織，加入Trizol試劑，勻漿裂解組織，按Trizol試劑說明書提取各組總RNA。按TaKaRa試劑盒說明書，以10 μl體系反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以獲得的cDNA為模板行qRT-PCR擴增。BKα上游引物：5′-ATCACCTGACAACAGCCCAG-3′，下游引物：5′-CAGGACGCTAACGGCAAATG-3′；BKβ上游引物：5′-TAGA-GCTCCAAGGCCTGACT-3′，下游引物：5′-ACAGTCATTTAGTTCCCTGGGT-3′；GAPDH上游引物：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。

1.3.4 大鼠結(jié)腸SMCs的培養(yǎng)、傳代、鑒定：10～12 d齡SD雌性乳鼠，斷頭處死后，取結(jié)腸10 cm，剝除腸管的漿膜和黏膜層，將留下肌層組織剪碎勻漿，離心、消化、重懸細(xì)胞，過細(xì)胞篩網(wǎng)(100目)，臺盼藍(lán)染色確認(rèn)細(xì)胞活力>90%，均勻接種于培養(yǎng)皿，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)95%的O2、5%的CO2的條件下進行原代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長至致密單層時，可進行傳代，取2～3代SMCs進行實驗。α-SMA標(biāo)記結(jié)腸SMCs，免疫熒光法鑒定[4]。

1.3.5 大鼠結(jié)腸SMCs上BK表達(dá)：將結(jié)腸SMCs上BKα、BKβ分別與α-SMA進行免疫雙標(biāo)，取生長良好的SMCs，消化接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待SMCs長至單層時，組化PBS沖洗，加質(zhì)量濃度為40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS沖洗，加質(zhì)量濃度為100 g/L的山羊血清封閉1 h后，加BKα/BKβ抗體(兔1∶100)和α-SMA一抗(小鼠1∶100)，陰性對照不加一抗，4 ℃過夜；PBS沖洗，避光，加Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶100)和FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗(1∶100)，37 ℃孵育1 h，PBS沖洗；DAPI染核10 min，PBS沖洗，鏡下觀察特異性熒光。

1.3.6 大鼠結(jié)腸SMCs分組及干預(yù)：取對數(shù)生長的2～3代SMCs，饑餓12 h后隨機分組處理。BSA-E2濃度分組：E2分為0、10、50、100 nmol/L，干預(yù)24 h。BSA-E2時間分組：50 nmol/L E2 干預(yù)0、6、12、24、48 h。按雌激素最適濃度及時間(50 nmol/L，干預(yù)24 h)，分為以下幾組：(1)對照組：含2 μl DMSO的DMEM培養(yǎng)液；(2)E2組：含50 nmol/L E2的DMEM培養(yǎng)液；(3)DPN組：含1 μmol/L DPN的DMEM培養(yǎng)液；(4)PPT組：含1 μmol/L PPT的DMEM培養(yǎng)液；(5)EI組：1 μmol/L ICI 182780預(yù)處理1 h后，加含50 nmol/L E2的DMEM培養(yǎng)液；(6)BSA-E2組：含50 nmol/L BSA-E2的DMEM培養(yǎng)液。

以上實驗均重復(fù)3次。DMSO終濃度均不超過1‰。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠結(jié)腸平滑肌組織BK分布及表達(dá)免疫熒光雙標(biāo)示：BKα、BKβ(紅色)均可與α-SMA(綠色)共表達(dá)，DAPI染核后呈藍(lán)色，E2組熒光強度高于對照組、EI組及BSA-E2組(見圖1)。

Western blotting及qRT-PCR示：E2組BKα、BKβ蛋白及mRNA表達(dá)均高于對照組(BKα：3.98±0.286vs1.09±0.127，5.27±0.554vs1.26±0.077，BKβ：3.47±0.423vs1.12±0.098,4.34±0.409vs1.23±0.057，P均<0.05)，而EI組、BSA-E2組BKα、BKβ蛋白及mRNA表達(dá)與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(BKα：1.33±0.064、1.15±0.049vs1.09±0.127，1.25±0.15、1.13±0.096vs1.26±0.077;BKβ：1.17±0.150、1.23±0.080vs1.12±0.098，1.11±0.077、1.17±0.101vs1.23±0.057，P均>0.05)(見圖1)。

注：C：對照組；B：BSA-E2組；E：E2組；I：EI組。與E2組比較，*P<0.05。

2.2大鼠結(jié)腸SMCs鑒定及BK表達(dá)免疫熒光雙標(biāo)示：結(jié)腸SMCs經(jīng)DAPI染核后呈藍(lán)色，大部分細(xì)胞(95%以上)胞質(zhì)內(nèi)α-SMA呈綠色熒光,BKα、BKβ均呈陽性(胞膜、胞質(zhì)內(nèi)見紅色熒光)(見圖2)。

2.3不同濃度及不同時間E2對大鼠結(jié)腸SMCs上BK表達(dá)的影響與0 nmol/L組相比，E2 10、50、100 nmol/L組BKα、BKβ蛋白及mRNA表達(dá)均明顯升高(BKα：1.86±0.026、6.64±0.053、6.57±0.381vs1.07±0.623，1.87±0.074、7.83±0.675、7.45±0.485vs1.15±0.118，P均<0.05；BKβ：1.94±0.243、6.87±0.042、6.31±0.327vs1.12±0.012，1.89±0.174、8.08±0.381、7.33±0.456vs1.06±0.083，P均<0.05)(見圖3A～3B)，100 nmol/L組BK表達(dá)較50 nmol/L下降，故50 nmol/L為最合適濃度。

注：免疫熒光雙標(biāo)(400×)。

與0 h組相比，50 nmol/L E2刺激6、12、24、48 h均可上調(diào)BK蛋白及mRNA表達(dá)(BKα：1.69±0.326、3.56±0.257、6.25±0.137、6.11±0.357vs1.03±0.219，1.75±0.136、3.07±0.437、7.45±0.485、6.24±0.287vs1.15±0.118，P均<0.05；BKβ：2.34±0.167、4.39±0.352、7.65±0.258、7.01±0.339vs1.04±0.153，2.73±0.156、4.20±0.234、7.33±0.456、6.80±0.22vs1.06±0.083，P均<0.05)(見圖3C～3D)，刺激48 h后BK表達(dá)下降，故24 h為E2作用的最佳時間。

2.4鑒定E2促進BK表達(dá)的受體類型E2及雌激素β受體激動劑DPN組可顯著上調(diào)BK蛋白及mRNA表達(dá)(BKα：7.24±0.394、2.37±0.109vs1.05±0.273，7.45±0.485、2.4±0.055vs1.01±0.158，P均<0.05；BKβ：7.28±0.251、2.47±0.184vs1.09±0.149，7.33±0.456、2.22±0.236vs1.06±0.083，P均<0.05)，而雌激素α受體激動劑PPT組、雌激素受體阻斷劑ICI 182780組、BSA-E2組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)(見圖4)。

圖3 E2促進BK表達(dá)的最合適濃度及時間 A：E2不同濃度刺激后BK蛋白表達(dá)(Western blotting)；B：E2不同濃度刺激后BK mRNA

Fig3EffectsofdifferentconcentrationsandtimethatE2promotedBKexpressionA: expression of BK after stimulation with different concentrations of estradiol (Western blotting); B: expression of BK after stimulation with different concentrations of estradiol (qRT-PCR); C: expression of BK after stimulation with different time of estradiol (Western blotting); D: expression of BK after stimulation with different time of estradiol (qRT-PCR)

注：與對照組、PPT組、ICI組、BSA-E2組比較，*P<0.05。

Fig4IdentificationofreceptortypesthatE2promotedBKexpressionA: expression of BK(Western blotting), β-actin serves as an internal control; B: expression of BK (qRT-PCR)

3 討論

Ca2+是SMCs收縮的基礎(chǔ)，胞內(nèi)Ca2+濃度升高，Ca2+與鈣調(diào)蛋白結(jié)合,誘發(fā)平滑肌收縮蛋白間相互作用而產(chǎn)生收縮[13]。雌激素是否通過鈣依賴性途徑抑制結(jié)腸平滑肌收縮？其機制尚不明確。

BK可表達(dá)在結(jié)腸SMCs[14-15]，本研究通過免疫熒光也證實，在Ca2+進入SMCs引起興奮性動作電位后，BK通道參與負(fù)反饋機制：增加K+外流、細(xì)胞復(fù)極甚至超極化致SMCs興奮性降低、抑制Ca2+內(nèi)流，使SMC胞內(nèi)Ca2+濃度下降，促使平滑肌舒張[16]。LI等[17]發(fā)現(xiàn)，在小鼠和人神經(jīng)元細(xì)胞系中，E2可上調(diào)BK通道各亞基的表達(dá)，HU等[18]發(fā)現(xiàn)，羊妊娠狀態(tài)下(雌孕激素增高)，子宮動脈SMCs中BK通道的β1亞基表達(dá)顯著增加，子宮動脈血管緊張度下降，血流量增加，均與本研究一致。

雌激素與特異性受體結(jié)合發(fā)揮作用，經(jīng)典的ER包括ERα、ERβ，近年來發(fā)現(xiàn)另一種G蛋白偶聯(lián)的ER(G protein coupled estrogen receptor，GPER)，多位于細(xì)胞膜[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，雌激素β受體激動劑可上調(diào)BK表達(dá)，而α受體激動劑、非細(xì)胞膜通透的BSA-E2處理后對BK表達(dá)無明顯影響，提示E2可通過β受體途徑促進BK的表達(dá)，這與LI等[17]研究結(jié)果一致。

本研究只檢測了BKα、BKβ的表達(dá)，尚需后續(xù)檢測其通道開放及Ca2+濃度變化。ERβ依賴的BK高表達(dá)是否直接介導(dǎo)了E2抑制結(jié)腸平滑肌收縮有待進一步研究。