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    肝細(xì)胞癌中SETDB1的表達(dá)及其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響

    2018-11-20 01:22:18
    關(guān)鍵詞:兔抗人抗體陽(yáng)性

    (西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科,四川 瀘州 646099)

    肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我國(guó)最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1-2]。編碼基因位于人類染色體1q21上的SET結(jié)構(gòu)域分支型1(SET domain bifurcated 1, SETDB1)是一種組蛋白賴氨酸N端甲基轉(zhuǎn)移酶[3-5]。有研究顯示,前列腺癌及非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)的SETDB1對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲具有促進(jìn)作用,并且能對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行評(píng)價(jià)[6-7]。本研究檢測(cè)HCC中SETDB1的表達(dá),通過敲除SETDB1研究其對(duì)肝癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖凋亡能力的影響。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    1.1.1 臨床資料 選取2014年1月-2016年3月于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科行手術(shù)切除的50例HCC患者的組織標(biāo)本及35例因肝外傷或肝血管瘤而切除患者的正常肝組織標(biāo)本。所有標(biāo)本于離體30 min內(nèi)取材,于中性甲醛溶液中保存、固定。

    1.1.2 細(xì)胞來(lái)源及主要試劑 肝癌MHCC97H細(xì)胞購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù),并由本科實(shí)驗(yàn)室保存。SETDB1特異性shRNA慢病毒顆粒(病毒載體類型:psi-LVRH1GP)購(gòu)自廣州復(fù)能基因公司,DMEM(11965-084)、胎牛血清(16000044)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒(FITC/PI雙染法,E606336)購(gòu)自上海生工生物工程有限公司,Trizol試 劑(15596026)、RT-PCR試劑盒(SuperScript?One-Step RT-PCR System with Platinum? Taq DNA Polymerase, 10928042) 及qPCR試劑盒(DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit, F415L)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,兔抗人SETDB1單克隆抗體(#2196)、兔抗人組蛋白H3單克隆抗體(#9717)、兔抗人H3K9me3單克隆抗體(#13969)、兔抗人p53單克隆抗體(#2527)及兔抗人β-actin單克隆抗體(#4970)購(gòu)自美國(guó)CST公司;兔SP免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

    1.2 免疫組織化學(xué)染色

    將石蠟包埋的標(biāo)本組織切片常規(guī)進(jìn)行脫蠟及水化預(yù)處理;用抗體稀釋液按1∶100比例稀釋兔抗人SETDB1多克隆抗體,滴加抗體于組織切片上并充分浸沒組織標(biāo)本。4℃恒溫冰箱內(nèi)孵育過夜,洗凈未結(jié)合一抗后,使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗結(jié)合相應(yīng)一抗,DAB法顯示陽(yáng)性蛋白。每張組織切片在400倍視野下隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行閱片。>10%癌細(xì)胞胞核呈棕黃色或棕褐色染色即為陽(yáng)性,否則判定為陰性。

    1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒感染

    MHCC97H細(xì)胞于適宜環(huán)境中培養(yǎng),穩(wěn)定傳2代或3代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將MHCC97H細(xì)胞按過夜增殖至愈合度達(dá)70%的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。達(dá)到預(yù)定培養(yǎng)密度后移除培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline, PBS)充分洗滌細(xì)胞。慢病毒感染分組:每孔加入1 ml sh-SETDB1慢病毒上清液、2 ml完全培養(yǎng)基及15μg Ploybrene作為sh-SETDB1組;每孔加入1 ml sh-Control慢病毒上清液、2 ml完全培養(yǎng)基及15μg Ploybrene作為sh-Control組。轉(zhuǎn)染48 h后,使用含2μg/ml Puromycin的完全培養(yǎng)液篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

    1.4 qRT-PCR

    通過Trizol試劑提取標(biāo)本及細(xì)胞RNA,配制逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增體系。逆轉(zhuǎn)錄條件:50℃預(yù)變性30 min,94℃變性2 min,循環(huán)1次后94℃變性15 s,60℃退火30 s,68℃延伸3 min,循環(huán)40次后72℃繼續(xù)延伸10 min。通過2-△△Ct法計(jì)算SETDB1基因的相對(duì)含量。

    1.5 Western blot檢測(cè)

    采用RIPA試劑提取細(xì)胞總蛋白,凝膠垂直電泳分離蛋白,70 V恒壓轉(zhuǎn)膜150 min,5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)室溫封閉1 h;用3%濃度的脫脂奶粉溶液按1∶1 000比例稀釋SETDB1、H3K9me3、p53及β-actin抗體。在4℃下孵育相應(yīng)條帶過夜。洗去殘余一抗后采用1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔或抗鼠二抗室溫孵育條帶1 h。于暗室內(nèi),增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法觀察蛋白表達(dá)。每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

    1.6 平板克隆形成試驗(yàn)

    將MHCC97H細(xì)胞按500個(gè)/孔均勻接種于6孔板中,更換完全培養(yǎng)基2次/周。培養(yǎng)2周后,使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min,1%結(jié)晶紫染色15 min,置于蒸餾水中洗去多余染液。風(fēng)干后將6孔板置于網(wǎng)格紙上統(tǒng)計(jì)每孔克隆形成數(shù)量,計(jì)算克隆形成率。每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

    1.7 流式細(xì)胞術(shù)

    將MHCC97-H細(xì)胞用預(yù)冷PBS工作液沖洗2次,胰酶消化細(xì)胞后1 500 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞,預(yù)制緩沖液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/ml,將500μl細(xì)胞懸液與5μl Annexin V-FITC及10μl PI混合,室溫遮光反應(yīng)10 min后上機(jī)測(cè)試。

    1.8 裸鼠皮下移植瘤模型的復(fù)制

    6只5周齡BLAB/c裸鼠,隨機(jī)分為sh-SETDB1組和sh-Control組,每組3只,分組后各組適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sh-SETDB1和sh-Control細(xì)胞,以冷PBS溶液制成細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞終濃度為2.0×107個(gè)/ml。使用1 ml注射器,將0.2 ml細(xì)胞懸液(約含4.0×106個(gè)細(xì)胞)接種于裸鼠背部近右下肢處皮下組織內(nèi),復(fù)制裸鼠皮下移植瘤模型。裸鼠飼養(yǎng)4周,每周測(cè)量腫瘤長(zhǎng)度及寬度,按(長(zhǎng)軸×短軸2)/2來(lái)計(jì)算腫瘤體積,繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較用t檢驗(yàn)或單因素方差分析,計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,比較用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 SETDB1蛋白在HCC和正常肝組織中的陽(yáng)性表達(dá)

    免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn),SETDB1位于細(xì)胞核。50例HCC組織中SETDB1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為80.00%(40/50),35例正常肝組織中SETDB1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為31.43%(11/35),經(jīng)χ2檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.238,P=0.000)。見圖1。

    圖1 SETDB1在HCC和正常肝組織中的表達(dá)

    2.2 不同影響因素下的SETDB1陽(yáng)性表達(dá)

    HCC組織中不同直徑腫瘤比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),SETDB1陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤體積增大關(guān)系密切。見表1。

    表1 不同影響因素下的SETDB1陽(yáng)性表達(dá)率比較

    2.3 沉默SETDB1表達(dá)對(duì)MHCC97H細(xì)胞增殖、凋亡的影響

    sh-Control組SETDB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為(1.00±0.00),sh-SETDB1組 為(0.38±0.11), 經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.219,P=0.017)。sh-Control組SETDB1蛋白相對(duì)表達(dá)量為(0.46±0.08),sh-SETDB1組為(0.17±0.02),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.071,P=0.036)。sh-SETDB1組抑制MHCC97H細(xì)胞克隆率為(81.34±10.29)%,sh-Control組為(53.22±8.31)%,經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì) 學(xué) 意 義(t=4.025,P=0.029)。sh-SETDB1組 促進(jìn)MHCC97H細(xì)胞凋亡率為(31.45±6.19)%,sh-Control組為(18.08±5.33)%,經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.740,P=0.031)。見圖 2。

    圖2 沉默SETDB1表達(dá)對(duì)MHCC97H細(xì)胞增殖、凋亡的影響

    2.4 沉默SETDB1表達(dá)對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響

    sh-SETDB1組MHCC97H細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)速度為(0.010±0.004)cm3/d,sh-Control組為(0.050±0.010)cm3/d,經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.605,P=0.039)。飼養(yǎng)4周后處死動(dòng)物獲取皮下腫瘤,sh-SETDB1組最終腫瘤體積為(1.34±0.31)cm3,sh-Control組為(0.41±0.12)cm3,經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.581,P=0.031)。見圖3。

    2.5 沉默SETDB1表達(dá)對(duì)MHCC97H細(xì)胞中H3K9me3和p53表達(dá)的影響

    sh-Control組MHCC97H細(xì)胞中H3K9me3的表達(dá)水平為(0.73±0.09),sh-SETDB1組為(0.13±0.02),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.427,P=0.025)sh-Control組 p53的表達(dá)水平為(0.67±0.06),sh-SETDB1組 為(0.21±0.04), 經(jīng)t檢 驗(yàn), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.060,P=0.041),sh-Control組H3的表達(dá)水平為(0.42±0.03),sh-SETDB1組為(0.39±0.02),兩組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.036,P=0.205)。SETDB1并未調(diào)控組蛋白H3的表達(dá),而是通過調(diào)控組蛋白H3甲基化抑制p53的表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。見圖4。

    圖3 沉默SETDB1表達(dá)對(duì)MHCC97H細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的影響

    圖4 沉默SETDB1表達(dá)對(duì)MHCC97H細(xì)胞內(nèi)H3K9me3和p53表達(dá)的影響

    3 討論

    SETDB1作為一種蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶,實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明其能與異染色質(zhì)蛋白1及其共抑制子KAP1在異染色質(zhì)中結(jié)合而促進(jìn)H3K9me3形成[8-9]。本研究的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,50例HCC組織中SETDB1的陽(yáng)性表達(dá)率要高于35例正常肝組織,并且高表達(dá)SETDB1的患者腫瘤體積增大。說(shuō)明在臨床上檢測(cè)肝癌組織中SETDB1的表達(dá)對(duì)判斷患者腫瘤進(jìn)展有一定參考價(jià)值。

    目前,雖然在許多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了SETDB1的異常表達(dá),但是其具體的生物學(xué)功能尚不完全清楚[10]。在非小細(xì)胞肺癌中,SETDB1通過正向激活WNT-βcatenin信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖,相似的生物學(xué)作用也存在于腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中[11-12]。但是WU等[13]的研究結(jié)果卻指出,SETDB1能與SMAD2和SMAD3形成SETDB1/SMAD2/3抑制性復(fù)合體來(lái)抑制TGF-β誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。在本研究中,筆者通過細(xì)胞增殖及凋亡實(shí)驗(yàn)表明,體外沉默SETDB1的表達(dá)致使肝癌MHCC97H細(xì)胞的增殖能力受到抑制。除此之外,動(dòng)物腫瘤生長(zhǎng)模型也指明,下調(diào)SETDB1的表達(dá)能夠抑制MHCC97H細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)。綜合上述結(jié)果表明,下調(diào)SETDB1的表達(dá)是抑制肝癌生長(zhǎng)的有效手段之一。SETDB1能夠特異性甲基化組蛋白H3的K9位點(diǎn),形成甲基化的組蛋白H3K9me3。有研究指出,H3K9me3的形成與包括p53在內(nèi)的許多抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的基因失活有關(guān)[14]。在本研究中,筆者在沉默SETDB1表達(dá)后發(fā)現(xiàn)H3K9me3的表達(dá)水平降低,而p53的表達(dá)水平升高,提示SETDB1促腫瘤生長(zhǎng)可能與抑制p53的表達(dá)有關(guān)。另外,p53在肺癌中還可能作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合在SETDB1的啟動(dòng)子區(qū)域,抑制其轉(zhuǎn)錄過程[15]。說(shuō)明p53與SETDB1存在復(fù)雜的相互制約關(guān)系。在HCC中p53的失活是一種普遍現(xiàn)象,這也部分揭示了SETDB1在HCC中高表達(dá)的原因[16]。

    綜上所述,SETDB1是HCC中高表達(dá)的促癌分子,沉默SETDB1的表達(dá)可能通過恢復(fù)p53的表達(dá)而抑制HCC增殖并促進(jìn)其凋亡。

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