胸腺素 β4和 β10表達促進小鼠乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移

馬 麗，石榮珍，鄧九零，邵錦暉，高建莉

（浙江中醫(yī)藥大學，浙江杭州 310053）

乳腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，近年來我國乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，嚴重危害了女性健康。乳腺癌早期不具有典型的癥狀及體征，一旦發(fā)現(xiàn)往往已處于晚期。乳腺癌的遠處轉(zhuǎn)移是引起患者死亡的最重要原因。乳腺癌一般通過淋巴結轉(zhuǎn)移、血道轉(zhuǎn)移及直接蔓延轉(zhuǎn)移至肺、骨、肝等器官，轉(zhuǎn)移過程迅速。因此，研究乳腺癌轉(zhuǎn)移機制具有重要意義。

胸腺素最早是從小牛胸腺中提取獲得的一組小分子多肽，分為α，β和γ家族，其中胸腺素β4（thy?mosin β4，Tβ4）和Tβ10是Tβ家族中的2類，是由多個氨基酸殘基組成的肌動蛋白單體結合蛋白［1-2］。有文獻報道，Tβ4和Tβ10在肺癌、肝癌、食管癌和結腸癌等多種惡性腫瘤組織中表達明顯增強，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲密切相關［3-4］。在腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成、細胞凋亡和創(chuàng)傷愈合等多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用。但Tβ4和Tβ10對乳腺癌的影響尚不清楚。

腫瘤轉(zhuǎn)移過程極其復雜，涉及多種基因。大量資料證明，基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metallopro?teinase-2，MMP2）和MMP9在胃癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌及膀胱癌等惡性腫瘤組織中的表達顯著上升，并與腫瘤細胞遷移有關［5］；信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transducers and activators of transcrip?tion 3，Stat3）能影響腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲；癌基因c-myc是調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長的癌基因之一，可激活腫瘤細胞生長抑制基因；骨髓基質(zhì)細胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，Sdf1）是由骨髓基質(zhì)細胞及其他相關細胞分泌的一種趨化因子，與腫瘤細胞增殖、浸潤及定向遷移有關。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Tβ4和Tβ10在小鼠乳腺癌組織及正常組織中的表達水平存在顯著差異，但關于Tβ4和Tβ10對小鼠乳腺癌增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲的影響目前尚未有相關報道。本研究旨在通過體內(nèi)外實驗探究Tβ4和Tβ10對小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響，并初步探索其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞、試劑和儀器

雌性BALB/c裸小鼠，SPF級，4～6周齡18只，體質(zhì)量14～16 g，許可證號碼：SCXK（滬）2013-0016，上海西普爾必凱實驗動物有限公司；飼養(yǎng)條件：溫度 22～25℃，濕度 60%～80%，光照時間7∶00-19∶00，每日更換水、飼料和墊料。本實驗內(nèi)容經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學實驗動物管理與倫理委員會通過，所有實驗動物操作均按浙江省實驗動物管理辦法進行。小鼠乳腺癌細胞4T1和熒光素酶標記的4T1-Luc細胞由芝加哥大學何通川教授惠贈，細胞用DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、青霉素1×105U·L-1和鏈霉素0.1 g·L-1），在37℃，飽和濕度及5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每1～2 d按1∶4傳代。

胎牛血清（批號：A66E00F，美國Gemini公司）；DMEM培養(yǎng)基（批號：8117065，賽默飛世爾儀器有限公司）；對照腺病毒（pENTER）、Tβ4過表達腺病毒（TMSB4X）和Tβ10過表達腺病毒（TMSB10）（山東維真生物科技有限公司），Tβ4檢測引物，F(xiàn)：AGAAGCTTCCAGCAACCATGTCCGA；R：GCATTTTGGATCCTGCAAGACATCTT；Tβ10 檢測引物，F(xiàn)：TGGCAGACAAACCAGACATGG，R：CGAAGAGGACGGGGGTAGG；胰蛋白酶（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司）；磷酸鹽緩沖液粉末、青霉素-鏈霉素溶液、Hoechst 33258染色液（碧云天生物技術研究所）；四甲偶氮唑藍（methyl thiazolyltetrazolium，MTT）、二甲亞砜、聚凝胺（美國Sigma公司）；甲紫（結晶紫，中國上海標本模型廠）；異氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；乙酸（杭州化學試劑有限公司）；甲醛溶液（上海凌峰化學試劑有限公司）；基質(zhì)膠、24孔板和Transwell小室（美國BD Biosciences公司）。培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿（美國BD Falcon公司）；BJ-2CD超凈工作臺（上海博訊實業(yè)有限公司）；離心機（德國Eppendorf公司）；MULTISKAN-FC酶標儀（美國Thermo公司）；MCO-18AIC細胞培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；PMI-3000B熒光倒置顯微鏡（德國徠卡公司）；7500型實時熒光定量PCR（美國ABI公司）。

1.2 MTT和甲紫法檢測4T1細胞增殖

取對數(shù)生長期的4T1細胞，按每孔1×104均勻接種于96孔板，待細胞長至85%～90%，分別加入0.5 μL pENTER,TMSB4X或TMSB10病毒液，每孔加入2 μL聚凝胺以促進感染，每組3個復孔，培養(yǎng)24，48和72 h后，參照文獻［6］中MTT法，測定每組吸光度（A）值，實驗重復3次，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（%）=〔1-（TMSB4X 或TMSB10組A值-空白組A值）/（pENTER組A值-空白組A值）〕×100%。甲紫法檢測4T1細胞增殖能力：取對數(shù)生長期的4T1細胞，按每孔5×104均勻接種于24孔板，待細胞長至85%～90%，分別加入2.5 μL pENTER,TMSB4X或TMSB10病毒液，每孔加入2 μL聚凝胺以促進感染，每組3個復孔，培養(yǎng)24，48和72 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入400 μL 0.2%結晶紫染液，室溫染色30～40 min后棄去染料，干燥后每孔加500 μL 20%醋酸，搖床振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長560 nm處讀取A值，實驗重復3次，計算細胞增殖抑制率。

1.3 劃痕法檢測4T1細胞遷移能力

4T1按每孔5×104細胞均勻接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，過夜后，使用200 μL規(guī)格的槍頭在板底劃“一”字形劃痕。每孔分別加入2.5 μL對應腺病毒，每孔加入7 μL聚凝胺提高感染率，培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，顯微鏡下隨機選取6個視野拍照，實驗重復3次。細胞遷移率（%）=〔（0 h寬度-24 h寬度）/0 h寬度〕×100%。

1.4 Transwell法檢測4T1細胞侵襲能力

不同腺病毒感染后的4T1細胞培養(yǎng)24 h，收集細胞并制備細胞懸液。參考文獻［7］的方法，上室加5×1044T1細胞，下室加500 μL含3%FBS的培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱中放20 h后，取出小室并擦去小室內(nèi)部的基質(zhì)膠和未遷移細胞，多聚甲醛固定20 min，Hoechst33258染色30 min，取下小室底部薄膜，顯微鏡下每組隨機選取5個視野拍照計數(shù)穿孔細胞，計算侵入到下室的細胞數(shù)目。實驗重復3次。

1.5 小鼠乳腺癌模型制備

選取健康BALB/c裸小鼠18只，2%異氟烷氣霧麻醉小鼠后，于左側(cè)倒數(shù)第2對乳腺脂肪墊皮下接種分別感染了對照腺病毒（pENTER組）、過表達Tβ4腺病毒（TMSB4X組）或Tβ10腺病毒（TMSB10組）腺病毒36 h的熒光素標記4T1細胞（每只1×106細胞），制備4T1乳腺癌小鼠模型［8］。造模成功后，每周于小鼠瘤體內(nèi)注射10 μL對應腺病毒。每隔5 d用游標卡尺測量瘤體長徑L（mm）和短徑W（mm），計算瘤體積（V）。V（mm3）=（L+W）×L×W×0.2618。

1.6 小鼠活體熒光成像觀察腫瘤生長和轉(zhuǎn)移

造模成功后第7天開始，每周每只小鼠腹腔注射熒光素酶底物0.1 mL，自由活動5 min后放入吸入式麻醉機麻醉后進行活體熒光成像，檢測小鼠腫瘤生長和轉(zhuǎn)移（連續(xù)5周）。第35天，頸椎脫臼處死。剖取肺及腫瘤組織，肉眼觀察臟器色澤、質(zhì)地并稱質(zhì)量。肺組織用甲醛固定48 h后，計數(shù)肺組織表面轉(zhuǎn)移灶數(shù)量，游標卡尺測量瘤灶大小，計算肺轉(zhuǎn)移率。肺轉(zhuǎn)移率（%）=（發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的小鼠數(shù)/每組小鼠總數(shù)）×100%。

1.7 RT-PCR檢測4T1細胞MMP2，MMP9，Stat3，c-myc和Sdf1 mRNA水平

取1×1064T1細胞分別感染相應腺病毒24 h后，根據(jù)說明書用Trizol試劑分離提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。按說明書（2×SGFast PCR Master Mix）配制反應體系，每個樣本設置3復孔，PCR儀進行擴增，擴增條件為：94℃ 15 s，53℃20 s，72℃ 41 s，共41個循環(huán)，75℃延伸3 min?；蛳鄬Ρ磉_用2-△△Ct計算，以GAPDH作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。

Tab.1 Sequence of primers

1.8 統(tǒng)計學分析

實驗結果數(shù)據(jù)用表示。使用SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)。通過單因素方差分析（one-way ANOVA）和t檢驗評估平均值差異的顯著性，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胸腺素 β4和 β10對4T1細胞增殖的影響

甲紫和MTT結果顯示（圖1，表2），Tβ4 和Tβ10過表達腺病毒作用4T1細胞24，48和72 h時，與pENTER組相比，TMSB4X和TMSB10組4T1細胞增殖及增殖抑制率無明顯變化。

Fig.1 Effect of thymosin β4（T β 44）and T β10 on prolifer?ation of 4T1 cells by crystal violet viability assay.4T1 cells were infected with 2.5 μL control adenovirus （pENTER），Tβ4 overexpression adenovirus （TMSB4X）and Tβ10 overexpression adenovirus （TMSB10）.Inhibition of cell proliferation was detected at 24，48 and 72 h，respectively.

Tab.2 Effect of T β4 and T β10 on proliferation of 4T1 cells by MTT

2.2 胸腺素 β4和 β10對4T1細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結果（圖2）顯示，不同腺病毒作用4T1細胞24 h后，對照pENTER組細胞遷移率為（22±7）%，TMSB4X和TMSB10組細胞遷移率分別為（36±6）%和（36±4）%（P＜0.05），表明Tβ4和Tβ10明顯促進了4T1細胞的遷移。

2.3 胸腺素 β4和 β10對4T1細胞侵襲能力的影響

Transwell法結果（圖3）顯示，不同腺病毒作用4T1細胞20 h后，pENTER組穿過小室的細胞數(shù)目為179±25，TMSB4X和TMSB10組穿過小室的細胞數(shù)目分別為197±30和230±27，差異無統(tǒng)計學意義，提示Tβ4和Tβ10對4T1細胞的侵襲無明顯影響。

2.4 胸腺素 β4和 β10對乳腺癌模型小鼠4T1細胞生長和轉(zhuǎn)移的影響

Fig.2 Effect of thymosin β4 and β10 on migration of 4T1 cells.See Fig.1 for cell treatment.Cell migration rate was detected at 24 h post infection.B was the semi-quantitative result of A.，n=3，＊P＜0.05，compared with pENTER group.

Fig.3 Effect of T β4 and T β10 on invasion of 4T1 cells.See Fig.1 for the cell treatment.Number of cells passing through Transwell was detected at 20 h.B was the semi-quantitative result of A.

乳腺癌模型小鼠實驗結果（圖4A）顯示，各組小鼠瘤體積無統(tǒng)計學差異。小鼠活體熒光成像數(shù)據(jù)（圖4B）顯示，28 d時，pENTER組小鼠乳腺癌未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，TMSB4X和TMSB10組小鼠乳腺癌開始出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。與pENTER組相比，TMSB4X和TMSB10組小鼠肺表面結節(jié)增多（P＜0.05），肺轉(zhuǎn)移率較高，但瘤質(zhì)量變化無統(tǒng)計學意義（表3）。表明Tβ4和Tβ 10對小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移具有促進作用。

Fig.4 Effect of T β4 and T β10 on growth and metastasis of breast cancer in mice.Breast cancer mice were injected with 10 μL pENTER，TMSB4X，or TMSB10 per week for 5 weeks，Tumor volume was measured every 5 d，tumor growth and metastasis in mice were observed by bioluminescence imaging every week.A：Tumor volume；B：Bioluminescence imaging at 28 d.＊P＜0.05，compared with pENTER group.

Tab.3 Effect of T β4 and T β10 on tumor mass,lung metastasis and pulmonary surface nodules of breast cancer in mice

2.5 胸腺素 β4和 β10對4T1細胞MMP2，MMP9，Stat3，c-myc和Sdf1 mRNA水平的影響

RT-PCR結果（圖5）顯示，不同腺病毒作用4T1細胞24 h后，與pENTER組相比，TMSB4X和TMSB10組4T1細胞MMP2，MMP9，Sdf1和Stat3mRNA水平顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），c-mycmRNA水平較pENTER組無差異。

Fig.5 Effect of T β4 and T β10 on mRNA level of MMP2，MMP9，Stat3，c-myc and Sdf1 in 4T1 cells by RT-PCR.4T1 cells were infected with 12.5 μL pENTER，TMSB4X or TMSB10 for 24 h before detected.，n=3，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with pENTER group.

3 討論

本研究結果表明，Tβ4及Tβ10均顯著促進小鼠乳腺癌的轉(zhuǎn)移。兩者體外均能促進4T1細胞的遷移，但對增殖和侵襲無顯著影響。其促進乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用可能與上調(diào)MMP2，MMP9，Sdf1和Stat3mRNA水平有關。

在細胞水平研究發(fā)現(xiàn)，Tβ4能顯著促進4T1細胞的遷移，對增殖和侵襲無顯著影響。與以前報道的Tβ4可明顯促進黑色素瘤B16-F10細胞的遷移、而對B16-F10細胞的侵襲及增殖無明顯影響一致［9］。Ryu等［10］研究發(fā)現(xiàn)，Tβ4能誘導蛋白激酶磷酸化，進而負性調(diào)節(jié)糖原合成酶激酶3α、β連環(huán)素和E鈣黏糖蛋白表達，促進胃癌細胞的遷移。Tβ4的肽鏈結構能與肌動蛋白結合，影響腫瘤細胞的運動［11］。Tβ4能夠使細胞中E鈣黏糖蛋白表達下調(diào)，β連環(huán)素表達增加，細胞間黏附性降低進而促進腫瘤細胞的生長［12］。但Tβ4對不同腫瘤細胞增殖的作用差異較大，機制尚不明確。有報道稱，結腸SW480細胞中Tβ4過表達能導致細胞骨架中微絲結構的破壞，促進細胞大量增殖［13］。Tang等［14］發(fā)現(xiàn)Tβ4可能通過提高IQ基序三磷酸鳥苷酶激活蛋白1（IQ motif containing GTPase activating protein 1，IQGAPI）/整合素連接激酶（integrin-link kinase，ILK）復合物的水平激活Ras相關性C3肉毒毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1）基因，從而促進結腸癌細胞的遷移。

Tβ4與Tβ10有85%同源性。本研究結果顯示，Tβ10對4T1細胞的影響與Tβ4相似，Tβ10也能促進4T1細胞的遷移，而對增殖及侵襲無明顯影響。據(jù)報道，Tβ10在乳腺癌、食管癌、黑色素瘤和結腸癌等癌組織中高表達，而在相應的正常或良性組織中則未見表達，其表達水平與乳腺癌、胰腺癌、甲狀腺癌的轉(zhuǎn)移能力和惡化程度呈正相關［15］。但也有學者發(fā)現(xiàn)，Tβ10過表達能抑制膽管癌細胞的遷移，而Tβ10沉默則能促進膽管癌細胞的遷移，其抑制作用與低表達的Tβ10激活Ras，上調(diào)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular regulated kinase 1/2，ERK1/2）水平有關［16］。Tβ10在不同腫瘤細胞中的作用具有差異性，Tβ10肽鏈中部與Tβ4具有一致的保守序列，也能與肌動蛋白結合形成復合物來調(diào)節(jié)肌動蛋白纖維的組裝，進而影響細胞骨架的重排，影響腫瘤細胞的運動［17］。細胞運動能力的增強是促進腫瘤細胞遷移的重要因素之一，腫瘤細胞轉(zhuǎn)移潛能的增高伴有肌動蛋白多聚體的丟失和微絲結構的解聚，而Tβ10過表達與細胞骨架變化高度相關［18］。

小鼠乳腺癌模型的結果表明，TMSB4X和TMSB10組小鼠乳腺癌較早出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，且肺表面結節(jié)數(shù)較多。Kobayashi等［19］發(fā)現(xiàn)，Tβ4過表達的纖維肉瘤小鼠較Tβ4沉默的纖維肉瘤小鼠更易發(fā)生腫瘤遠處轉(zhuǎn)移Cha等［9］發(fā)現(xiàn)，Tβ4過表達較Tβ4沉默的B16-F10細胞所形成的腫瘤更易發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移。蘭海燕［20］發(fā)現(xiàn)，Tβ10在正常乳腺組織及癌旁組織中不表達，而在乳腺癌癌細胞質(zhì)中呈彌漫表達，與本研究結果一致。

本研究檢測了幾種與細胞遷移有關的基因的表達水平。結果顯示，Tβ4和Tβ10均能夠上調(diào)4T1細胞MMP2，MMP9和Sdf1mRNA的水平，顯著上調(diào)Stat3mRNA的水平，對c-mycmRNA的水平無顯著影響。MMP2和MMP9是細胞外基質(zhì)重塑和腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的明膠酶，其上調(diào)與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關。MMP2與MMP9均能夠促進血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的生成，其水平與胃癌淋巴結轉(zhuǎn)移呈正相關［21］。MMP2和MMP9也可與星形細胞上調(diào)基因1（astro?cyte elevated gene-1，AEG-1）相互作用從而促進甲狀腺癌的淋巴結轉(zhuǎn)移［22］。Sdf1能與宮頸癌Hela細胞表達的蛋白聚糖4（syndecan-4）形成復合物，增加Hela細胞MMP9的水平［23］，起到促進腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。有學者發(fā)現(xiàn)，Sdf1在非小細胞肺癌細胞中過表達，敲除Sdf1可以抑制肺A549細胞的生長和轉(zhuǎn)移［24］。Stat3可通過抑制腫瘤細胞產(chǎn)生的促炎癥反應細胞因子從而促進腫瘤的遷移［25］。據(jù)報道，Stat3能夠促進黑色素瘤的轉(zhuǎn)移，Stat3沉默可抑制黑色素瘤細胞的遷移［26］。以上結果說明，Tβ4與Tβ10促進乳腺癌細胞遷移并促進小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的作用，可能與其上調(diào)MMP，MMP9，Stat3和Sdf1水平有關。

腫瘤轉(zhuǎn)移是多個信號通路參與的多階段的復雜過程，腫瘤細胞經(jīng)過黏附、降解、運動遷移和血管生成等生物學過程最終發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。有學者檢測了大腸癌患者腫瘤組織及正常黏膜組織中Tβ4和VEGF基因的表達，發(fā)現(xiàn)二者的表達水平呈明顯正相關，且在腫瘤組織中二者表達水平較高，說明Tβ4促進腫瘤的轉(zhuǎn)移還可能與促進腫瘤血管的生成有關［27］。與Tβ4相似，Tβ10的過表達能夠影響VEGF的生成進而影響腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移［18］。體外實驗發(fā)現(xiàn)，Tβ10通過干擾Ras抑制其下游信號通路，減少VEGF的生成，進而抑制血管生成。

本研究未能進一步研究Tβ4和Tβ10研究4T1細胞VEGF的影響及其及其與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關系，也未考察沉默Tβ4和Tβ10后乳腺癌轉(zhuǎn)移的變化。上述內(nèi)容值得進一步研究?？傊?，Tβ4和Tβ10過表達與小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移及4T1細胞遷移有關，有望成為對抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的新治療靶點，對開發(fā)抗乳腺癌藥物的新型治療策略具有重要意義。