• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      柴胡皂苷b2通過抑制線粒體凋亡通路減輕過氧化氫誘導(dǎo)的L-02細(xì)胞損傷

      2018-11-20 07:51:50高子涵王紅偉呂行直何云霞王建剛李瑞芳
      關(guān)鍵詞:羅丹明存活率蛋白酶

      高子涵,王紅偉,呂行直,何云霞,劉 玲,王建剛,李瑞芳

      (河南科技大學(xué)1.醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系,2.護(hù)理學(xué)院,河南洛陽 471023)

      目前,我國肝病的患病率居高不下,診斷和治療藥物的療效也不盡如意。急性肝損傷是多類嚴(yán)重性肝病發(fā)生發(fā)展的初始環(huán)節(jié)和共同歷程。柴胡(Radix Bupleuri)在傳統(tǒng)中醫(yī)記載中常用于和解表里、疏肝解郁等。目前已應(yīng)用于臨床的柴胡制劑包括柴苓護(hù)肝顆粒、護(hù)肝片和護(hù)肝膠囊等[1],其有效成分柴胡皂苷(saikosaponin,SS)具有解熱抗炎、免疫調(diào)節(jié)和保肝護(hù)腎等作用,且對肝的保護(hù)作用最佳[2-3]。SS的結(jié)構(gòu)包括環(huán)氧醚型(如SS-a,-c和-d等)和異環(huán)雙烯型(如SS-b1和-b2等),是五環(huán)三萜類齊墩果烷型衍生物[4]。其中SS-a,SS-c和SS-d有明顯的護(hù)肝和抗腫瘤等藥理作用[5-7],SS-d對實(shí)驗(yàn)性大鼠肝硬化有較強(qiáng)的抑制作用,還可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能,抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5,8-9]。SS-b2是SS的主要藥理活性成分之一,在柴胡中含量較低,在肝損傷防治方面的研究報(bào)道較少。本研究采用過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)L-02細(xì)胞損傷模型探討SS-b2對肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其與線粒體凋亡相關(guān)的分子機(jī)制。

      1 材料與方法

      1.1 細(xì)胞、藥品、試劑和儀器

      正常人肝細(xì)胞L-02(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心,本研究室保存?zhèn)鞔?。SS-b2(純度>99%,成都曼思特生物科技有限公司,17032104);RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶(美國Gibco公司);H2O2、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Hoechst33258、羅丹明123、BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液和ECL顯色劑試劑盒(Sigma公司);AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司);小鼠抗人Bcl-2、Bax、Cyt-c、β肌動蛋白、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3單抗(美國Santa Cruz公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

      細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Electron公司);SW-CJ-2J潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Nikon公司);Bio-TekELX800酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司);BD accuri C6流式細(xì)胞儀(美國BD公司);DYY-11B型三恒電泳儀和DYCP-31DN型電泳儀(北京六一儀器廠);Clinx ChemiScope2850熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)。

      1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

      復(fù)蘇的L-02細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中,于37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。2~3 d胰酶消化傳代1次,全程在超凈臺中無菌操作。

      1.3 MTT法檢測細(xì)胞存活率

      取對數(shù)生長期的L-02細(xì)胞,胰酶消化并計(jì)數(shù),稀釋后每孔5×103細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板,倒置顯微鏡下觀察,待細(xì)胞密度為70%~80%,分為正常對照組、模型組和SS-b2組,每組4復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。正常對照組和模型組給予等量培養(yǎng)液,SS-b2組分別加入SS-b2 12.5,25,50和100 mg·L-1(終濃度)預(yù)處理24 h后,除正常對照組外,其余各組再加入H2O2100 μmol·L-1繼續(xù)孵育12 h,而后每孔加入20 μL MTT(5 g·L-1),4 h后棄培養(yǎng)上清液,再加入200 μL DMSO,避光振蕩10 min,用酶標(biāo)儀于波長490 nm處檢測吸光度(A490nm)值。細(xì)胞存活率(%)=藥物組A490nm/正常對照組A490nm×100%。

      1.4 羅丹明123染色法檢測L-02細(xì)胞線粒體膜電位變化

      接種L-02細(xì)胞于6孔板,細(xì)胞分組與藥物處理同1.3。吸出含藥培養(yǎng)基,用PBS洗細(xì)胞3次,加入終濃度為100 μg·L-1羅丹明123染色液浸潤細(xì)胞,37℃染色30 min,加細(xì)胞固定液1 mL,37℃固定1 h,最后滴加抗熒光衰減封片劑,于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長530 nm),ImageJ熒光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

      1.5 Hoechst33258染色觀察L-02細(xì)胞凋亡

      接種L-02細(xì)胞于6孔板,細(xì)胞分組與藥物處理同1.3。棄含藥培養(yǎng)液,每孔加細(xì)胞固定液(4%多聚 甲 醛)400 μL,室 溫 固 定 10 min,PBS 洗3次,再加1 mL Triton X-100 5 g·L-1,室溫5 min后PBS洗3次,最后加入Hoechst33258染色液(5 mg·L-1)1 mL,于37℃孵育5~10 min后吸去Hoechst33258染色液,PBS洗3次,每次5 min;用熒光顯微鏡(激發(fā)波長350 nm,發(fā)射波長360 nm)觀察核固縮、核碎裂和高亮藍(lán)色熒光等凋亡形態(tài)學(xué)特征,計(jì)數(shù)視野內(nèi)凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

      1.6 流式細(xì)胞儀檢測L-02細(xì)胞凋亡率

      接種L-02細(xì)胞于6孔板,細(xì)胞分組與藥物處理同1.3。吸出培養(yǎng)液,用PBS洗細(xì)胞2次,加入胰酶消化,用培養(yǎng)液終止消化并離心收集細(xì)胞,按照BD公司AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作步驟進(jìn)行。用1×結(jié)合緩沖液〔HEPES/NaOH 0.1 mol·L-1(pH 7.4),NaCl 1.4 mol·L-1,CaCl225 mmol·L-1〕重懸細(xì)胞,使細(xì)胞密度為1×109L-1。取100 μL細(xì)胞懸液置5 mL培養(yǎng)管中,依次加入AnnexinⅤ-FITC(20 mg·L-1)和PI(50 mg·L-1)各5 μL,混勻。室溫避光反應(yīng)20 min,立即使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

      1.7 Western蛋白印跡法檢測細(xì)胞線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)

      接種L-02細(xì)胞于6孔板,細(xì)胞分組與藥物處理同1.3。收集細(xì)胞并加入RIPA裂解液,提取各組細(xì)胞總蛋白,定量,經(jīng)SDS-PAGE電泳后,將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉37℃封閉1 h,分別加入抗β肌動蛋白、Bcl-2、Bax、Cyt-c、胱天蛋白酶9和3抗體(一抗)(均1∶1000),37℃孵育1 h;TBST洗3次后,加入二抗(1∶6000)于37℃孵育1 h,ECL發(fā)光顯色,采用Gel-Pro analyzer4.0凝膠定量分析軟件,對蛋白條帶積分吸光度值進(jìn)行半定量分析。以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度的比值表示目的蛋白相對表達(dá)水平。

      1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

      實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均以表示,用SPSS17.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Tukey′s檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 SS-b2對H2O2損傷的L-02細(xì)胞存活率的影響

      H2O2100 μmol·L-1處理12 h后,模型組細(xì)胞存活率下降至(45.4±1.3)%(P<0.01);與模型組比較,SS-b2預(yù)處理24 h顯著抑制H2O2所致的L-02細(xì)胞損傷,SS-b2 12.5,25,50和100 mg·L-1組細(xì)胞存活率分別上升至(51.6±1.4)%,(56.5±2.4)%,(64.4±1.5)%和(74.6±3.7)%(P<0.05,P<0.01),并呈濃度依賴性(r=0.9804,P<0.05)(表1)。

      2.2 SS-b2對H2O2誘導(dǎo)的L-02細(xì)胞線粒體損傷的影響

      羅丹明123在正常細(xì)胞中能依賴線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì),胞漿熒光強(qiáng)度減弱或消失。細(xì)胞凋亡時,線粒體膜完整性破壞,線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放,引起線粒體跨膜電位(ΔΨm)的崩潰,羅丹明123被釋放出線粒體,從而胞漿發(fā)出強(qiáng)黃綠色熒光。與正常對照組相比,模型組細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(P<0.01);SS-b2 12.5,25和50 mg·L-1組綠色熒光強(qiáng)度較模型組綠色熒光強(qiáng)度顯著降低(P<0.01),提示SS-b2能減輕H2O2誘導(dǎo)的L-02細(xì)胞線粒體損傷(圖1)。

      Tab.1 Effect of saikosaponin-b2(SS-b2)on cell viability of L-02 cells treated with hydrogen peroxide(H2O2)

      2.3 SS-b2對H2O2誘導(dǎo)的L-02細(xì)胞凋亡的影響

      Hoechst33258染色結(jié)果(圖2)顯示,正常對照組細(xì)胞形態(tài)均一,細(xì)胞核呈圓形或橢圓形;模型組細(xì)胞核固縮,呈高亮藍(lán)色熒光,細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01);與模型組相比,SS-b2 12.5,25和50 mg·L-1組細(xì)胞核固縮現(xiàn)象明顯減輕,細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05,P<0.01),且呈濃度依賴關(guān)系(r=0.8193,P<0.05)。

      流式細(xì)胞檢測結(jié)果(圖3)顯示,模型組細(xì)胞凋亡率較正常對照組明顯升高〔(68.4±6.3)%vs(3.5±1.6)%〕(P<0.01);與模型組比較,SS-b2 12.5,25和50 mg·L-1組細(xì)胞凋亡率分別降為(64.8±5.4)%,(47.9±3.4)%和(44.3±3.5)%,其中SS-b2 25和50 mg·L-1組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),提示SS-b2對H2O2誘導(dǎo)的L-02細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用。

      2.4 SS-b2對L-02細(xì)胞線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白的影響

      與正常對照組比較,模型組細(xì)胞Bax(P<0.01),Cyt-c(P<0.01),胱天蛋白酶9(P<0.05)和3(P<0.05)蛋白表達(dá)顯著升高,而Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01);與模型組相比,SS-b2 12.5,25和50 mg·L-1組Bax,胱天蛋白酶9和3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01),SS-b2 25和50 mg·L-1組Cyt-c蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01),而SS-b2 12.5,25和50 mg·L-1組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01),使Bcl-2/Bax的比值升高,且呈濃度依賴性(r=0.9417,P<0.01)(圖5)。

      Fig.1 Effect of SS-b2 on mitochondrial injury of L-02 cells treated with H2O2by Rhodamine123 staining(×200).See Tab.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.,n=6.**P<0.01,compared with normal control group;##P<0.01,compared with model group.

      Fig.2 Effect of SS-b2 on apoptosis of L-02 cells treated with H2O2by Hoechst33258 staining(×200).See Tab.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.n=6.**P<0.01,compared with normal control group;#P<0.05,##P<0.01,compared with model group.

      Fig.3 Effect of SS-b2 on apoptosis rate of L-02 cells treated with H2O2by flow cytometry.See Tab.1 for the cell treat?ment.B was the semi-quantitative result of A.,n=6.**P<0.01,compared with normal control group;##P<0.01,compared with model group.

      Fig.4 Effect of SS-b2 on expressions of apoptosis related proteins in L-02 cells treated with H2O2by Western blotting.See Tab.1 for the cell treatment.B-F were the semiquantitative results of A.G was ratio of Bcl-2 to Bax.,n=6.*P<0.05,**P<0.01,compared with normal control group;##P<0.01,compared with model group.

      3 討論

      本研究以L-02細(xì)胞為研究對象,觀察了SS-b2對H2O2誘導(dǎo)的體外肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與H2O2損傷組相比,SS-b2可明顯提高受損L-02細(xì)胞的存活率,減少H2O2引起的核固縮和核碎裂等凋亡形態(tài)改變,減少細(xì)胞凋亡。羅丹明123染色結(jié)果也表明,SS-b2能明顯改善氧化應(yīng)激引起的L02細(xì)胞線粒體損傷。

      細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生一系列的活性氧(reac?tive oxygen species,ROS),包括氧自由基、H2O2及下游氧化產(chǎn)物等。研究發(fā)現(xiàn),大量ROS可通過氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞功能紊亂甚至死亡[10]。H2O2可作為信使參與細(xì)胞內(nèi)氧化還原途徑,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。H2O2具有膜滲透性,更易穿透細(xì)胞膜造成細(xì)胞損傷,引起線粒體膜電位下降。H2O2可活化線粒體通透轉(zhuǎn)變通道,使線粒體膜通透性增加、孔道開放,線粒體內(nèi)容物(如Cyt-c)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),通過Apaf-1與胱天蛋白酶9形成凋亡小體,最終激活胱天蛋白酶3,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。本研究結(jié)果表明,H2O2處理后促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào),而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào),Bcl-2/Bax比值降低,胱天蛋白酶3激活;SS-b2可升高Bcl-2/Bax比值,使線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白Cyt-c、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3的蛋白表達(dá)水平顯著降低。

      綜上所述,SS-b2可明顯減輕氧化應(yīng)激導(dǎo)致的L-02細(xì)胞損傷,其機(jī)制可能與保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)、減少線粒體凋亡及減輕細(xì)胞損傷有關(guān)。

      猜你喜歡
      羅丹明存活率蛋白酶
      園林綠化施工中如何提高植樹存活率
      損耗率高達(dá)30%,保命就是保收益!這條70萬噸的魚要如何破存活率困局?
      水產(chǎn)小白養(yǎng)蛙2年,10畝塘預(yù)計(jì)年產(chǎn)3.5萬斤,畝純利15000元!存活率90%,他是怎樣做到的?
      思鄉(xiāng)與蛋白酶
      文苑(2018年22期)2018-11-19 02:54:30
      多胚蛋白酶 高效養(yǎng)畜禽
      IgA蛋白酶在IgA腎病治療中的潛在價值
      原位合成H4SiW12O40@C協(xié)同UV/H2O2降解羅丹明B模擬廢水
      光助Fenton法處理羅丹明B廢水的研究
      冷卻豬肉中產(chǎn)蛋白酶腐敗菌的分離鑒定
      Alice臺風(fēng)對東海鮐魚魚卵仔魚的輸運(yùn)和存活率的影響
      固始县| 牡丹江市| 固阳县| 喜德县| 德阳市| 清远市| 承德县| 涞水县| 尼勒克县| 葫芦岛市| 英吉沙县| 镇康县| 东乡族自治县| 赣榆县| 渑池县| 米脂县| 定结县| 尖扎县| 驻马店市| 新绛县| 开远市| 镇雄县| 沂南县| 砀山县| 秀山| 墨竹工卡县| 平南县| 成武县| 深圳市| 德兴市| 会东县| 灵台县| 莱西市| 乐陵市| 公主岭市| 淮阳县| 南平市| 新邵县| 疏勒县| 威海市| 松原市|