基于Illumina高通量測(cè)序技術(shù)分析草莓表面微生物結(jié)構(gòu)

戴寶玲， 肖英平， 戴賢君， 何祥祥， 王佩佩， 楊 華

(1.中國計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310018； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江杭州 310021；

3.浙江省植物有害生物防控省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江杭州 310021)

草莓(Fragaria×ananassaDuch.)作為一種即食性水果，在冬春季節(jié)的市場(chǎng)上是最受消費(fèi)者歡迎的水果之一。草莓營養(yǎng)豐富，柔嫩多汁，口味酸甜，此外還含有豐富的維生素和人體必需的礦物質(zhì)和微量元素，素有水果皇后的美譽(yù)[1]。草莓廣泛種植于我國南方大部分地區(qū)，浙江省作為我國早熟草莓的主產(chǎn)區(qū)之一，其生產(chǎn)質(zhì)量直接關(guān)系到東南地區(qū)及全國早熟草莓的銷售狀況和食用安全。成熟后的草莓果實(shí)嬌嫩多汁，含水量達(dá)到95%，因此在成熟過程中，為有害微生物生長提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，極易受到微生物(如細(xì)菌、真菌)的感染，成為草莓生長以及食用的安全隱患之一[2]。在我國，微生物學(xué)指標(biāo)中，致病菌是判斷食品衛(wèi)生的重要依據(jù)。因此對(duì)食用草莓開展致病微生物檢查與鑒定試驗(yàn)，探尋草莓食用安全的關(guān)鍵控制點(diǎn)是一項(xiàng)關(guān)系食品安全的重要工作[3]。然而，傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法相對(duì)落后，而高通量測(cè)序等新技術(shù)的引入，將極大地提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

利用無菌袋，對(duì)浙江省2個(gè)地區(qū)的8個(gè)草莓種植基地進(jìn)行抽樣，每個(gè)地區(qū)抽取4個(gè)基地，編號(hào)分別為JD1、JD2、JD3、JD4、JD5、JD6、JD7、JD8。

1.2 基因組DNA提取及擴(kuò)增

草莓表面微生物DNA的提取采用ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM(Zymo Research)(真菌/細(xì)菌DNA小量提取試劑盒)進(jìn)行提取。將8個(gè)不同基地采集的草莓樣本分別用無菌生理鹽水沖洗后離心，將得到的沉淀用200 μL生理鹽水重懸后加入到鋯鋇珠裂解管(ZR BashingBead lysis tube)，然后按照試劑盒說明書的提取方法操作，提取的DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)分析。

以提取的草莓表面細(xì)菌DNA為模板，采用引物338 F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGAC-TACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3 測(cè)序和質(zhì)量控制

應(yīng)用Illumina HiSeq 2000測(cè)序儀對(duì)草莓表面細(xì)菌的16S rRNA基因的V3～V4區(qū)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

對(duì)于得到的測(cè)序原始數(shù)據(jù)通過QIIME軟件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，V 1.7.0，http：//qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)對(duì)獲得的序列進(jìn)行質(zhì)控和過濾，剔除低質(zhì)量的DNA序列[4-5]。根據(jù)相似性≥97%的原則，將質(zhì)控的有效序列聚類成系統(tǒng)操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)。通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析構(gòu)建了稀釋性曲線圖來評(píng)價(jià)所測(cè)序量是否覆蓋基地草莓表面細(xì)菌的全部類群。采用ChaoⅠ指數(shù)、辛普森(Simpson)指數(shù)和香農(nóng)(Shannon)指數(shù)等評(píng)估樣品微生物物種的多樣性以及其豐富度。將測(cè)序的結(jié)果利用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種匹配，統(tǒng)計(jì)在門和屬水平上的基地草莓表面細(xì)菌組成及菌群分布情況，并繪制菌群豐度圖、菌群豐度熱點(diǎn)圖等柱狀圖。基于加權(quán)UniFrac距離(weighted uniFrac distance)的分析，用主坐標(biāo)分析(PCoA)方法處理，比較不同基地所獲得樣品表面微生物結(jié)構(gòu)的差異，繪制PCoA散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓樣品微生物物種豐度及多樣性

通過篩選，在8個(gè)不同草莓基地中，最終獲得301 924條有效序列，平均每個(gè)基地37 741(范圍：11 438～70 004)條，測(cè)序的結(jié)果如表1所示，各樣品最終獲得572～924個(gè)OTU，各樣品的覆蓋度(coverage)指數(shù)范圍為0.987～0.997，表明樣品中的序列幾乎都被檢出，此結(jié)果可以反應(yīng)樣品中的真實(shí)多樣性組成。以分別從8個(gè)基地隨機(jī)抽到的草莓表面微生物樣品的序列數(shù)與它們代表的OTU數(shù)目構(gòu)建稀釋性曲線，結(jié)果(圖1)可以看出，各樣品曲線相對(duì)平坦，更多的測(cè)序序列只會(huì)產(chǎn)生少量新的OTU，說明測(cè)序序列數(shù)量合理，測(cè)序深度能夠滿足分析要求[6]。進(jìn)一步進(jìn)行OTU聚類分析，通過ChaoⅠ指數(shù)和ACE指數(shù)來評(píng)估基地草莓表面的菌群豐度，Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)來評(píng)估菌群的多樣性。

表1 樣品測(cè)序概況

2.2 草莓表面細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)

從微生物分類門的水平上(圖2)來看，8個(gè)基地中，草莓表面微生物較為豐富，主要包含變形菌門、厚壁菌門、藍(lán)藻細(xì)菌、放線菌門、擬桿菌門、軟壁菌門、綠彎菌門、螺旋體門、酸桿菌門、疣微菌門等。變形菌門、厚壁菌門和藍(lán)藻細(xì)菌門是基地草莓表面微生物的優(yōu)勢(shì)菌門，分別共占每個(gè)基地草莓微生物的80%以上，其相對(duì)豐度分別為37.99%(變化范圍為 15.07%～56.85%)、33.55%(變化范圍為21.78%～55.23%)、23.29%(變化范圍為3.10%～7.35%)。8個(gè)基地草莓表面微生物的種類無明顯的差異，只是各種微生物的豐度有差異。其中JD1、JD2、JD7草莓表面微生物中，變形菌門細(xì)菌均占50%以上。JD4、JD5和JD6草莓表面微生物的厚壁菌門豐度大致相同，在25%～35%之間。李橋通過高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)土壤中變形菌門和厚壁菌門細(xì)菌也為優(yōu)勢(shì)菌種，可能是因?yàn)椴葺麑?shí)貼地生長，直接與土壤接觸，感染了土壤微生物[7]。

從屬的水平上(圖3)進(jìn)一步分析，8個(gè)基地中草莓表面微生物種類較豐富。優(yōu)勢(shì)菌屬主要為布赫納氏菌屬、甲基桿菌屬和葡糖桿菌屬，其相對(duì)豐度分別為7.94%(2.19%～44.56%)、4.78%(0.87%～10.02%)和4.49%(0.28%～33.15%)。JD1和JD2含有的微生物相對(duì)較多，總體均超過了50%，其中葡糖桿菌屬和布赫納氏菌屬所占比例較大，分別為33.14%和44.56%。JD5、JD6、JD7和JD8甲基桿菌屬較其他菌含量多。

在微生物分類屬的水平上進(jìn)行分析，從細(xì)菌豐度熱點(diǎn)圖(圖4)明顯看出JD4、JD5和JD7分別檢出豐度較高的寡養(yǎng)單胞菌屬、葡萄球菌屬、苯基桿菌屬和埃希桿菌屬，這4種微生物都有一定的致病性。其中JD4寡養(yǎng)單胞菌屬細(xì)菌相對(duì)豐度為2.04%，它雖不是一個(gè)高度致命的病原體，但已成為重要的病原體，被感染患有菌血癥的病人死亡率為14%～69%[8-9]，可引起肺部感染和膽道敗血癥[10]；苯基桿菌屬目前包括5種，在JD5基地草莓表面檢測(cè)到其菌群豐度為 1.45%，可引起皮膚感染，形成肉芽腫，能夠寄生在人體內(nèi)并感染細(xì)胞使細(xì)胞致病[11]；JD7埃希桿菌屬菌群豐度為0.96%，可引起呼吸道、泌尿道等感染[12]；JD4葡萄球菌屬菌群豐度占0.33%，可引起人和動(dòng)物的化膿性感染(表2)。另外，JD3檢出瘤胃球菌屬，瘤胃球菌屬存在于牛和綿羊的瘤胃等處，可能來自農(nóng)家肥的施用。JD8檢測(cè)出根瘤菌屬，根瘤菌主要存在于土壤中，具有固氮作用。

2.3 草莓樣品的主坐標(biāo)分析

通過主坐標(biāo)分析(圖5)可見，PC1和PC2分別解釋55.45%和18.5%差異性。PCoA圖表明， 各處理樣可分為3個(gè)集合，其中JD5、JD6、JD7、JD8聚在一起， 可能是因?yàn)檫@4個(gè)基地處于同一地區(qū)，所以微生物差異不大，JD1、JD2、JD4聚在一起，而JD3單獨(dú)。有些草莓表面被污染的微生物有很大差異，可能是因?yàn)椴葺刂g相距較遠(yuǎn)，其生長的環(huán)境和土質(zhì)不同。

表2 8個(gè)基地4種致病菌相對(duì)豐度

3 結(jié)論

本試驗(yàn)應(yīng)用了Illumina高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)浙江省8個(gè)草莓基地草莓表面微生物，了解其分布情況、菌群結(jié)構(gòu)及生物多樣性間的差異和豐富度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)草莓表面細(xì)菌菌群主要分布于10個(gè)門，變形菌門、厚壁菌門和藍(lán)藻細(xì)菌門是基地草莓表面微生物的優(yōu)勢(shì)菌門。在屬的水平上發(fā)現(xiàn)草莓表面存在一定的寡養(yǎng)單胞菌屬、苯基桿菌屬、埃希桿菌屬和葡萄球菌屬等病原菌，其衛(wèi)生安全應(yīng)該給予重視?；夭葺砻娴奈⑸镂廴局饕獊碓从诨丨h(huán)境，基地草莓順地生長，不同基地環(huán)境及土壤微生物的差異，可能是導(dǎo)致草莓表面微生物多樣性的原因。許多研究已經(jīng)證實(shí)微生物多樣性的變化與熏蒸劑和殺蟲劑有關(guān)[13-15]。因此，基地草莓生產(chǎn)者在種植時(shí)應(yīng)注意對(duì)土壤和環(huán)境實(shí)施有效的消毒措施。