中國(guó)肉桂與越南清化肉桂葉解剖結(jié)構(gòu)對(duì)比分析

梁曉靜 ，梁海英 ，梁文匯 ，李開(kāi)祥

（1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院 a.八角肉桂工程中心；b.廣西特色經(jīng)濟(jì)林培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.廣西木本香料工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530002；2.克萊姆森大學(xué)，南卡羅來(lái)納州 克萊姆森 29634）

肉桂C.cassia在我國(guó)已有2 000多年的栽培歷史，主要分布在北回歸線附近地區(qū)[1]，廣西和廣東是肉桂的主產(chǎn)區(qū)，其中廣西的分布面積最廣，約占全國(guó)的50%以上。此外，福建、海南、云南和四川等省區(qū)也有少量栽培[2]。國(guó)內(nèi)種植的當(dāng)家品種為中國(guó)肉桂，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的人工栽培和自然選擇，已經(jīng)形成了不同品種和品系，在廣西，肉桂按產(chǎn)地分為“東興桂”和“西江桂”[3]。西江桂主要分布在藤縣、平南、桂平、岑溪、容縣、蒼梧、梧州等地，而東興桂主要分布在防城、上思、大新和龍州等地[4]。

清化肉桂C.cassiavar.macrophyll產(chǎn)自越南清化省，亦稱西貢桂，清化肉桂桂皮品質(zhì)好，在國(guó)際市場(chǎng)上享有較高榮譽(yù)，Dao在過(guò)去20多年里研究越南樟屬植物，認(rèn)為所謂的清化桂其實(shí)與中國(guó)肉桂是同一個(gè)種，但是由于收獲和加工工藝的不同，越南清化桂和中國(guó)肉桂的產(chǎn)品在外表上有著很大的差別[5]。邢繼真對(duì)清化肉桂和中國(guó)肉桂桂皮的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了對(duì)比分析，結(jié)果表明，兩者的顯微結(jié)構(gòu)部基本一致，但清化肉桂的石細(xì)胞和木纖維較少，細(xì)胞內(nèi)含紅棕色物質(zhì)多[6]。傅火帶研究比較了清化肉桂和中國(guó)肉桂揮發(fā)油的差異，認(rèn)為清化肉桂辣味小，葉油的折光率、含醛量高，成分有所不同，認(rèn)為是兩個(gè)不同的種[7]。

植物的葉片是進(jìn)行光合作用和蒸騰作用的主要器官[8]，其形態(tài)結(jié)構(gòu)在一定程度上說(shuō)明其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和進(jìn)化機(jī)制，以及種源地環(huán)境對(duì)植物形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響程度[9]。不少學(xué)者應(yīng)用葉片的解剖特征作為分析親緣關(guān)系的佐證，邱芬等研究了不同倍性滇楊葉解剖結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果表明，對(duì)滇楊進(jìn)行加倍處理之后，其葉片解剖結(jié)構(gòu)與二倍體對(duì)照相比較發(fā)生了顯著變化[10]。招禮軍等對(duì)5個(gè)種源鵝掌楸葉解剖性狀進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其解剖性狀在種間和種內(nèi)存在著豐富的變異[11]。

目前對(duì)于不同品種肉桂的研究主要包括：揮發(fā)油成分[12]、葉形態(tài)多樣性[13]、遺傳物質(zhì)多樣性[14]、木材結(jié)構(gòu)特性[15]等方面，而葉片解剖結(jié)構(gòu)比較尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)不同品種肉桂葉片結(jié)構(gòu)的顯微觀察，探索相同生態(tài)和栽培條件下，不同肉桂品種葉片解剖結(jié)構(gòu)的差異，旨在為品種分類和肉桂資源的研究利用提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

位于廣西南寧市北郊，108°21′E，22°56′N，海拔95 m，屬亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，光照充足，年均日照時(shí)數(shù)為1 600 h～1 800 h；雨量豐沛，年降水量1 347.2 mm；空氣濕潤(rùn)，年平均相對(duì)濕度為80%；氣候溫和，年均氣溫在21.6 ℃左右，≥10 ℃年有效積溫在7 200 ℃，極端最低溫-1.5 ℃，極端最高溫度39.4 ℃，一般年份有2～4 d輕微霜凍；土壤是由沙頁(yè)巖發(fā)育而成的赤紅壤，pH值為4.5～6.0之間。

1.2 試驗(yàn)材料

供試的肉桂品種為越南清化肉桂和中國(guó)西江肉桂的優(yōu)良單株家系，為V-1，V-2，C-1、2、3、4、5、6、7、8、11號(hào)等11個(gè)家系，2006年，分別于越南清化省和廣西平南縣篩選的優(yōu)良單株并采集成熟種子，進(jìn)行實(shí)生苗培育，2007年春季，將一年生不同優(yōu)良單株家系苗木定植于廣西林科院肉桂資源圃，株行距為2 m×2 m，定植后按常規(guī)方法管理。

1.3 測(cè)定方法

每個(gè)樣本選擇3株，選取生長(zhǎng)一致，健康無(wú)病蟲(chóng)害的、向陽(yáng)的葉片，連中脈一起剪成1.0 cm×0.5 cm的小塊，立即放入FAA固定液中，固定24 h以上，再用不同梯度的酒精脫水，二甲苯透明，石蠟滲透包埋，用石蠟切片機(jī)切成4～10 μm厚的切片，脫水，番紅-固綠染色，中性樹(shù)膠封片，用Olympus光學(xué)顯微鏡觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)葉片選取3個(gè)橫切面，每個(gè)切面選取3個(gè)視野，每個(gè)視野測(cè)量一組數(shù)據(jù)，觀測(cè)指標(biāo)包括葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、柵海比、木質(zhì)部厚度、韌皮部厚度、中脈厚度、中脈突起度。按照以下公式計(jì)算柵海比和葉片突起度。柵海比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度，葉脈突起度(MPD) = 中脈橫切面厚度/葉片橫切面厚度。所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0進(jìn)行多重比較、主成分分析以及聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片橫切面解剖結(jié)構(gòu)比較

如圖1所示，中國(guó)肉桂和越南肉桂的橫切結(jié)構(gòu)均為典型的異面葉，由表皮、葉肉和葉脈三部分組成，上表皮細(xì)胞近方形，排列緊密，一層，厚度13.56～17.37 μm，下表皮為一層近圓形細(xì)胞，排列不規(guī)則，體積較上表皮細(xì)胞大，厚度為15.49～19.12 μm。肉桂葉肉細(xì)胞分化為柵欄組織和海綿組織，柵欄組織由1～2層柱狀細(xì)胞組成，排列較為疏松，厚度為52.06～56.62 μm，海綿組織細(xì)胞分布十分疏松，厚度為122.4～174.95 μm，柵海比為0.30～0.43 μm。葉脈為離基三出脈，中脈較粗，厚度為820.15～1 110.74 μm，其上表皮細(xì)胞與維管束之間有3～5層厚角組織，下表皮內(nèi)有6～8層排列疏松、體積較大的薄壁細(xì)胞，維管束為外韌維管束，橫切面呈扇形，維管束近軸面為發(fā)達(dá)的木質(zhì)部，木質(zhì)部厚度為136.05～238.36 μm，由多列徑向排列的導(dǎo)管和木射線，遠(yuǎn)軸面為韌皮部，韌皮部厚度為64.47～88.17 μm。韌皮部外為多層薄壁細(xì)胞組成的維管束鞘。

圖1 不同品種肉桂葉片解剖結(jié)構(gòu)Fig.1 Leaf anatomical structure of different varieties of C.cassia

由表1不同品種肉桂葉橫切面解剖特征多重比較可知，清化肉桂2個(gè)家系和中國(guó)肉桂9個(gè)家系的葉片厚度、上表皮厚度、海綿組織厚度、柵海比、木質(zhì)部厚度、中脈厚度之間存在顯著性差異，而下表皮厚度、柵欄組織厚度及中脈突起度之間差異不顯著。清化肉桂的葉片厚度、海綿組織厚度、木質(zhì)部厚度及中脈厚度的平均值分別為251.69、170.09、234.49、1 077.29 μm 顯著大于中國(guó)肉桂家系，中國(guó)肉桂家系葉片厚度、海綿組織厚度、木質(zhì)部厚度及中脈厚度的平均值分別為219.35、132.46、164.92、868.59 μm。清化肉桂的柵/海為0.31，中國(guó)肉桂柵/海為0.41，顯著小于中國(guó)肉桂。

2.2 肉桂品種各表型性狀的相關(guān)性分析

肉桂葉解剖結(jié)構(gòu)10個(gè)指標(biāo)的相關(guān)性如表2所示，兩兩指標(biāo)之間相關(guān)性最高的是葉片厚度和海綿組織厚度，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.976，其次是海綿組織厚度與中脈厚度，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.969，葉片厚度與木質(zhì)部厚度、中脈厚度之間也呈極顯著正相關(guān)（均為r=0.947），木質(zhì)部厚度與海綿組織厚度、中脈厚度之間呈極顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.942和0.930。負(fù)相關(guān)系數(shù)最大的海綿組織與柵/海之間，相關(guān)系數(shù)為-0.949，其次是中脈厚度與柵/海之間，相關(guān)系數(shù)為-0.904。

表1 不同品種肉桂葉橫切面解剖特征多重比較Table 1 Multiple comparison of anatomical features of transverse section of different varieties of C.cassia

表2 肉桂葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of anatomical structure index of leaves

2.3 不同品種肉桂葉片解剖結(jié)構(gòu)特征的主成分分析

肉桂葉解剖結(jié)構(gòu)的主成分分析如表3所示，前2個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別為63.290%、17.378%，累積貢獻(xiàn)率達(dá)80.668%，說(shuō)明這兩個(gè)主成分概括了10個(gè)解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的主要信息。在第一主成分中，葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、木質(zhì)部厚度、中脈厚度以及中脈突起度等指標(biāo)的特征向量均為正值，其中木質(zhì)部厚度的載荷量最大，為0.982，其次是葉片厚度、中脈厚度以及海綿組織厚度，載荷量分別為0.979、0.973和0.963。第二主成分中，信息載荷量最大的是下表皮厚度，為0.819，其次是韌皮部厚度，載荷量為0.727，其他指標(biāo)的信息載荷量均低于0.700。

表3 肉桂葉片解剖結(jié)構(gòu)特征的主成分分析Table 3 Principal component analysis of anatomical features of C.cassia leaves

10個(gè)變量集中于兩個(gè)個(gè)主成分中，以第一主成分特征向量為橫坐標(biāo)，第二主成分特征向量為縱坐標(biāo)，兩個(gè)個(gè)主成分相互垂直，構(gòu)成一個(gè)平面，葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)形成2個(gè)分布群，第一個(gè)分布群由木質(zhì)部厚度、葉片厚度、中脈厚度、海綿組織厚度、中脈突起度等5個(gè)指標(biāo)組成，第二個(gè)分布區(qū)群由柵欄組織厚度、韌皮部厚度、上表皮厚度、下表皮厚度和柵欄/海綿組織厚度等5個(gè)指標(biāo)組成（圖2所示）。

圖2 旋轉(zhuǎn)因子載荷分布圖像Fig.2 Load distribution diagram of rotation factor

2.4 基于葉片橫切面解剖特征的不同品種肉桂聚類分析

根據(jù)葉片解剖結(jié)構(gòu)10個(gè)指標(biāo)對(duì)肉桂的11個(gè)家系進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖3，當(dāng)截取值約為4時(shí)，11個(gè)家系分成兩組，V-1和V-2聚為一類，而中國(guó)肉桂9個(gè)家系聚為一大類，其中第二大類又分為兩個(gè)亞類，第一亞類為C-1和C-5，第二亞類為 C-2、C-3、C-4、C-6、C-7、C-8、C-11， 越 南清化肉桂2個(gè)家系與中國(guó)肉桂9個(gè)家系的遺傳距離最大，而中國(guó)肉桂的各個(gè)家系之間的截取值較小，這說(shuō)明，越南清化桂與中國(guó)肉桂葉片解剖結(jié)構(gòu)之間存在明顯的差異。

圖3 基于葉片橫切面解剖特征的不同品種肉桂聚類圖Fig.3 Cluster maps based on the anatomical characteristics of the transverse section

3 結(jié)論與討論

越南清化肉桂的桂皮又稱南玉桂，品質(zhì)優(yōu)于中國(guó)肉桂，國(guó)際市場(chǎng)上，清化肉桂桂皮價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于中國(guó)肉桂[4]，享有較高聲譽(yù)。有些學(xué)者認(rèn)為清化桂是中國(guó)肉桂的大葉變種，也有研究認(rèn)為清化桂和中國(guó)肉桂是同一個(gè)種，產(chǎn)品和外表上的差別是收獲方式和加工工藝不同所造成[5]。

為了探討中國(guó)肉桂和越南清化肉桂的親緣關(guān)系，運(yùn)用數(shù)量分析法對(duì)不同品種肉桂家系間葉的解剖結(jié)構(gòu)特征量進(jìn)行分析，從而將不同種分開(kāi)。有不少學(xué)者運(yùn)用數(shù)量分析法對(duì)群體間特定解剖結(jié)構(gòu)特征量進(jìn)行分析，以將不同的種或品種分開(kāi)，例如張永福等基于葉片解剖特征分析了3種無(wú)患子科果樹(shù)的親緣關(guān)系，得到三月紅是荔枝的一個(gè)變種，龍荔是由龍眼進(jìn)化到荔枝一個(gè)中間過(guò)渡物種的結(jié)論[16]。鄭瑞等對(duì)61個(gè)油茶品種的葉片及中脈橫切面解剖特征進(jìn)行了觀察，并對(duì)品種間的親緣關(guān)系進(jìn)行了初步研究并編制了分類檢索表，研究結(jié)果說(shuō)明：葉片橫切面解剖特征可作為區(qū)分油茶品種的依據(jù)之一[17]。

植物葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，各組織厚度及比值等結(jié)構(gòu)特征是植物遺傳性的反映，可作為植物分類的依據(jù)[18]。葉解剖結(jié)構(gòu)的差異是遺傳因子和環(huán)境因子共同作用的結(jié)果[11]，供試的2個(gè)肉桂品種11個(gè)家系來(lái)自同一時(shí)期，同一區(qū)域，出現(xiàn)的差異是植物葉片內(nèi)部的遺傳物質(zhì)作用下形成的不同形態(tài)結(jié)構(gòu)。中國(guó)肉桂和越南清化肉桂在葉的主要特征上表現(xiàn)出較高的一致性比如葉的輪廓，脈序，柵欄組織層和海綿組織層的分化程度，中脈結(jié)構(gòu)的排列等方面。而在葉片厚度、海綿組織厚度、柵海比、木質(zhì)部厚度、中脈厚度等方面存在顯著的差異。

主成分分析中，前兩個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)到80.668%，說(shuō)明這兩個(gè)主成分概括了10個(gè)性狀指標(biāo)的主要信息，可以反映不同品種肉桂在葉解剖結(jié)構(gòu)上的差異[19]。第一主成分貢獻(xiàn)率為63.290%，木質(zhì)部厚度的載荷量最大，其次是葉片厚度，中脈厚度，海綿組織厚度，這四個(gè)指標(biāo)信息載荷量最大，都達(dá)到0.900以上，是區(qū)分肉桂不同品種最主要的解剖結(jié)構(gòu)。聚類分析中，越南清化肉桂2個(gè)家系與中國(guó)肉桂9個(gè)家系各聚為一類，且遺傳距離最大，進(jìn)一步說(shuō)明清化桂和中國(guó)肉桂葉解剖結(jié)構(gòu)之間存在明顯的差異，是遺傳距離較遠(yuǎn)的種，這與之前肉桂葉表型性狀的研究結(jié)果一致[14]，認(rèn)為中國(guó)肉桂與越南清化肉桂是兩種不同的肉桂品種。

前人對(duì)植物親緣關(guān)系的鑒別經(jīng)歷了形態(tài)學(xué)、孢粉學(xué)、同工酶等研究方法，但這些研究方法受主觀影響較大[20,21]。除了闡明不同親緣物種共存的形態(tài)學(xué)和表型性狀外，從植物生理生化、分子、蛋白質(zhì)組和代謝組學(xué)水平上解析植物親緣識(shí)別的機(jī)制將是下一階段研究的重點(diǎn)[22]。肉桂品種分類仍然是按照形態(tài)指標(biāo)為主，存在主觀因素的影響，分類結(jié)果仍有爭(zhēng)議，今后肉桂種質(zhì)資源親緣關(guān)系的研究將以分子標(biāo)記以及基因組測(cè)序技術(shù)、指紋圖譜構(gòu)建、目標(biāo)基因定位及其連鎖圖譜繪制等方面為主。為合理利用肉桂資源提供指導(dǎo)。