金黃色葡萄球菌總RNA提取的研究

朱曉麗，劉口妍，任峰，陸娟，吳亮

（1.泰州市人民醫(yī)院 檢驗科，江蘇 泰州 225300；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.江南大學(xué)附屬醫(yī)院（無錫第四人民醫(yī)院），江蘇 無錫 214062）

0 引言

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是臨床重要致病菌，其耐藥性近年來日趨嚴(yán)重，其中耐藥甲氧西林的金黃色葡萄球菌（Methicillinresistant Staphylococcus aureus, MRSA）分離率已高達50%以上。金黃色葡萄球菌能導(dǎo)致嚴(yán)重癥狀的原因在于其擁有各種毒力因子，包括溶血表、腸霉素和殺白細胞素等[1]。在臨床治療中迫切需要在感染早期開展各種毒力因子檢測以避免各種嚴(yán)重感染并發(fā)癥發(fā)生，提高患者生存率[2]。通過RT-PCR技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌毒力因子編碼基因表達是一種最快捷簡便的技術(shù)，但金黃色葡萄菌堅固細胞壁阻礙了常規(guī)方法提純細菌總RNA[3]。本研究比較3種方法破壞金黃色葡萄球菌細胞壁效果，并獲得最佳抽提總RNA方法，現(xiàn)將結(jié)果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 菌株

4株金黃色葡萄球菌分離于我院患者，經(jīng)VitckⅡ Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)鑒定為金黃色葡萄球菌。各株細菌接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基，經(jīng)220轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)12 h用于細菌總RNA提取。

1.2 RNA提取

取1 mL過夜培養(yǎng)菌液，離心后去除培養(yǎng)基。分別采用3種方式提取細菌總RNA。

（1）Trizol直接提取。向菌液沉淀中加入1 mL Trizol，劇烈振蕩30 s后嚴(yán)格按照試劑操作說明書提取總RNA，最終溶解于50 μL無核酸酶雙蒸水中，用于后續(xù)研究。

（2）溶菌酶裂解后提取。向菌液沉淀中加入200 μL溶菌酶溶液（20 mg/mL）于37℃孵育1 h后離心，收集沉淀使用Trizol提取總RNA用于后續(xù)研究。

（3）溶葡球菌酶裂解后提取。向菌液沉淀中加入200 μL溶葡球菌酶溶液（10 mg/mL）于37℃孵育1 h后離心，收集沉淀使用Trizol提取總RNA用于后續(xù)研究。

1.3 RNA質(zhì)量鑒定

取5 μL總RNA提取產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖電泳（120 V，20 min），觀察RNA濃度和降解情況。

2 結(jié)果

3種方法提取RNA結(jié)果：采用Trizol法直接裂解細菌并抽提總RNA，其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測未發(fā)現(xiàn)RNA；采用溶菌酶預(yù)先裂解后使用Trizol法抽提細菌總RNA，其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測未發(fā)現(xiàn)RNA；采用溶葡球菌酶預(yù)先裂解后使用Trizol法抽提細菌總RNA，其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測發(fā)現(xiàn)RNA，且條帶清晰無降解（見圖1）。

圖1 三種方法提取金黃色葡萄球菌總RNA效果

3 討論

金黃色葡萄球菌是一種常見的致病菌，是引超食物中毒的主要病原菌，同時也引起人的多種感染性病疾，甚至造成危及生命的疾病，如肺炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎和敗血癥等。由金黃色葡萄球菌所導(dǎo)致的各種疾病已是世界范圍內(nèi)影響公共衛(wèi)生與健康的重要問題，開展細菌毒力因子檢測可以有效地評估細菌致病力，為預(yù)防嚴(yán)重感染的發(fā)生提供技術(shù)支持[4]。

金黃色葡萄球菌外部具有堅固的細胞壁，常規(guī)方法如煮沸、凍融均無法有效破壞。Trizol試劑具有較強裂解哺乳動物細胞能力，但本研究中我們發(fā)現(xiàn)其對金黃色葡萄球菌無裂解效果。溶菌酶（lysozyme）是本實驗中使用另一種裂解劑，該酶又稱胞壁質(zhì)酶（muramidase）或N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一種能水解細菌中黏多糖的堿性酶[5]。主要通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，使細胞壁不可溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細菌溶解。雖然金黃色葡萄球菌細胞壁也是由β-1,4糖苷鍵構(gòu)成，但本研究中發(fā)現(xiàn)普通溶菌酶無法破壞金黃色葡萄菌細胞壁，后續(xù)使用Trizol試劑無法提取出總RNA[6]。溶葡球菌酶（lysostaphin）也是本研究所使用的第三種裂解劑，該酶裂解金黃色葡萄球菌效果最佳。溶葡球菌酶是20世紀(jì)60年代從一株編號為NRRL B-2628的模仿葡萄球菌（S.simulan）中發(fā)現(xiàn)，該酶是一種含Zn2+的金屬蛋白酶，具有催化葡萄球菌細胞壁肽聚糖五肽橋水解的強大活性，其抗葡萄球菌尤其是金黃色葡萄球菌感染的藥用潛力也受人們的重視[7]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄不過經(jīng)溶葡球菌酶處理20 min后，可以方便地使用Trizol提純細胞總RNA，極大地方便臨床開展金黃色葡萄球菌各種耐藥基因和毒力基因表達檢測和研究[8]。