蘭茵鳳揚(yáng)化濁解毒方治療大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制

張 紈 張 晶 曹鵬飛 李 婭 孫建慧 陳天鴿 王彩云 李博林(河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 0500)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種慢性非特異性炎癥性疾病，病變主要累及結(jié)腸、直腸黏膜和黏膜下層。本病周期長(zhǎng)，可多次反復(fù)，遷延難愈。UC的發(fā)病原因和機(jī)制仍有諸多不明，目前多數(shù)認(rèn)為是幾種因素共同影響而引起腸道黏膜免疫功能紊亂所致〔1〕。其中備受矚目的便是以細(xì)胞因子介導(dǎo)的諸多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在炎癥性腸病的發(fā)病過(guò)程中的異常表達(dá)〔2〕。中醫(yī)藥治療UC顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)，濁毒內(nèi)蘊(yùn)是UC主病機(jī)，化濁解毒法是其基本治法〔3〕?；谝陨险J(rèn)識(shí)，本研究以UC大鼠為載體，以美沙拉嗪作對(duì)照，從δ阿片受體(DOR)-β抑制蛋白(β-arrestin1)-Bcl-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路探討蘭茵鳳揚(yáng)化濁解毒方治療UC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物源自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心〔SCXK(冀)2013-1-003〕，8周齡雄性 Wistar大鼠60只(體重為 200～250 g、清潔級(jí))。

1.2 主要藥物、試劑及儀器 蘭茵鳳揚(yáng)化濁解毒方包括佩蘭15 g、茵陳15 g、鳳尾草15 g、飛揚(yáng)草15 g、藿香12 g、佛手12 g、胡黃連 12 g、石榴皮12 g、白芍 15 g、兒茶6 g、地榆15 g等，上述藥物購(gòu)自河北省中醫(yī)院，由其制劑室制成高、中、低三種濃度混懸液(分別為5.00、2.50、1.25 g/ml)。美沙拉嗪腸溶片(佳木斯鹿靈制藥有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號(hào):140308)。2，4，6-三硝基苯磺酸(美國(guó)的Sigma公司);總RNA提取試劑(TaKaRa公司，Code No:9108);PCR反應(yīng)體系(TaKa-Ra公司，Code No:R004A);cDNA合成試劑盒(TaKa-Ra公司，Code No:62120A);DNA標(biāo)準(zhǔn)(TaKaRa公司，Code No:3427A)。PCR擴(kuò)增儀PE9600型(美國(guó)PE公司);高速冷凍離心機(jī)(1-15K，美國(guó)Sigma);電泳儀、電泳槽(北京六一)。

1.3 動(dòng)物模型制備〔4〕所有大鼠先適應(yīng)性飼養(yǎng)2 w，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)劃分為正常組10只和造模組50只。利用TNBS/乙醇法做UC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的準(zhǔn)備。模型制備過(guò)程中共死亡3只。造模3 d后，從造模組隨機(jī)抽取大鼠2只，斷頭處死，予取結(jié)腸組織標(biāo)本處理，確定其標(biāo)本組織出現(xiàn)了充血、水腫、糜爛及潰瘍形成等病理組織學(xué)改變，證明造模成功。

1.4 分組與給藥 造模組大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為模型組9只、中藥低、中、高劑量組各9只，美沙拉嗪組9只。空白組:常規(guī)飼養(yǎng)，不予任何干預(yù);模型組:生理鹽水灌胃(4 ml/kg，1次/d);美沙拉嗪組:美沙拉嗪混懸液灌胃(0.3 g/kg，1次/d);中藥低、中、高劑量組:分別給予低、中、高濃度蘭茵鳳揚(yáng)化濁解毒方混懸液灌胃(5、10、20 g/kg，1 次/d)。連續(xù)給藥 2 w。

1.5 標(biāo)本采集和處理 用藥2 w后，每組大鼠24 h禁食不禁水處理，稱重后，予斷頭處死。在病變最明顯部位(距肛門8 cm處)取2塊1 cm×1 cm標(biāo)本，生理鹽水沖洗干凈，使無(wú)殘留物，用冷凍管封存其中1塊組織并迅速放入液氮中保存，后移入－80℃冰柜保存。另一塊組織予常規(guī)石蠟包埋、HE染色處理。

1.6 觀察指標(biāo) ①疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分:參照文獻(xiàn)〔6〕中的DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。DAI=(便血分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù))/3。②結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)觀察。③RT-PCR檢測(cè)結(jié)腸組織中β-arrestin1、DOR、Bcl-2 mRNA表達(dá)情況

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 DAI評(píng)分比較 空白組 DAI評(píng)分為(0.00±0.00)分;模型組為(2.46±0.43)分，與模型組比較，中藥高、中、低劑量組〔(0.37±0.39)分、(0.81±0.29)分、(1.56±0.41)分〕與美沙拉嗪組〔(0.78±0.29)分〕DAI評(píng)分均明顯降低(P＜0.05);其中中藥高劑量組的DAI評(píng)分為最低值(P＜0.05);中藥中劑量組與美沙拉嗪組DAI評(píng)分無(wú)差異(P＞0.05)。

2.2 病理組織學(xué)觀察 與空白組比較，其余組大鼠結(jié)腸黏膜均有大小不同程度的破壞，如炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、腺體結(jié)構(gòu)被破壞，發(fā)生組織充血水腫、黏膜糜爛甚或潰瘍等變化。中藥高劑量組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)基本正常，充血水腫不甚明顯，僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，與空白組相似。中藥低劑量組黏膜仍有破壞，腺體結(jié)構(gòu)欠規(guī)則，較明顯的組織充血水腫，且有不少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，尚可見(jiàn)少量黏膜糜爛及潰瘍。美沙拉嗪組、中藥中劑量組介于兩組之間。

2.3 結(jié)腸組織中DOR mRNA與β-arrestin1 mRNA的表達(dá) 表1可知，與空白組比較，模型組中大鼠結(jié)腸組織的β-arrestin1、DOR mRNA表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05);與模型組比較，各中藥治療組與美沙拉嗪組的β-arrestin1、DOR mRNA表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05)。中藥高劑量組表達(dá)均低于中藥中劑量組、中藥低劑量組、美沙拉嗪組(P＜0.05)。與中藥低劑量組比較，美沙拉嗪組、中藥中劑量組表達(dá)水平降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與中藥中劑量組比較，美沙拉嗪組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 結(jié)腸組織中Bcl-2 mRNA的表達(dá) 表1可知，與空白組比較，模型組、中藥中、低劑量組及美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織中Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，中藥高劑量組升高無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。與模型組比較，中藥高、中、低劑量組及美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織中Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯下降(P＜0.05)。與中藥低劑量組比較，中藥中劑量組、美沙拉嗪組Bcl-2 mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與中藥中劑量組比較，美沙拉嗪組Bcl-2 mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 DOR、β-arrestin1、Bcl-2 mRNA的表達(dá)情況()

表1 DOR、β-arrestin1、Bcl-2 mRNA的表達(dá)情況()

與模型組比較:1)P＜0.05;與空白組比較:2)P＜0.05;與中藥高劑量組比較:3)P＜0.05;與中藥中劑量組比較:4)P＜0.05;與中藥低劑量組比較:5)P＜0.05

組別 n DOR mRNA β-arrestin1 mRNA Bcl-2 mRNA空白組 10 0.326 6±0.016 81) 0.320 9±0.018 61) 0.321 7±0.023 01)模型組 9 0.531 9±0.023 82) 0.521 7±0.021 52) 0.525 6±0.027 32)中藥高劑量組 9 0.347 3±0.011 01)2) 0.344 3±0.014 11)2) 0.335 0±0.014 21)3)中藥中劑量組 9 0.391 4±0.024 51)2)3)4) 0.405 2±0.028 91)3)4) 0.379 7±0.023 01)2)中藥低劑量組 9 0.451 5±0.020 91)2)3) 0.453 5±0.026 91)2)3) 0.434 9±0.020 31)2)美沙拉嗪組 9 0.373 3±0.019 11)2)3)4) 0.394 1±0.025 61)2)3)4) 0.357 3±0.010 61)2)4)5)

3 討論

目前，對(duì)于UC發(fā)生的病因乃至發(fā)病機(jī)制都不甚清楚。感染、遺傳因素、過(guò)敏、氧自由基損傷、免疫異常等均與本病的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。但是在目前臨床觀察中，多數(shù)研究認(rèn)為在其多種發(fā)病機(jī)制中，免疫異常居于核心地位，而造成免疫異常的關(guān)鍵環(huán)節(jié)就是細(xì)胞因子的紊亂，T細(xì)胞免疫功能失調(diào)所造成的自身免疫異常是UC發(fā)生的重要機(jī)制。紊亂的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)使T細(xì)胞在病損的腸道黏膜及固有層大量聚集，活化的T細(xì)胞進(jìn)一步促使炎癥細(xì)胞分泌，致使結(jié)直腸的上皮結(jié)構(gòu)廣泛缺失和在固有層發(fā)生炎癥改變，細(xì)胞因子相互作用造成的腸道炎癥性改變破壞了腸道黏膜穩(wěn)態(tài)，損傷了腸道屏障作用，這些病理性改變與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死密切相關(guān)〔6〕，目前細(xì)胞凋亡在結(jié)直腸黏膜的缺損及糜爛、潰瘍形成中的作用已形成共識(shí)〔7〕。越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為感染、遺傳、環(huán)境等異常可能作為起始因素導(dǎo)致腸道微環(huán)境改變，從而使腸道菌群突破腸上皮屏障，異?；罨喾N信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而以T淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞因子在腸黏膜內(nèi)大量釋放和聚集，使細(xì)胞凋亡抵抗作用加強(qiáng)，腸道免疫穩(wěn)態(tài)遭到破壞，繼而導(dǎo)致UC的發(fā)生〔8〕。因此，在UC發(fā)生的過(guò)程中，異常活化的信號(hào)通路及其所致的T淋巴細(xì)胞凋亡抵抗發(fā)揮著重要作用。

在T淋巴細(xì)胞的增殖分化過(guò)程中，DOR-β-arrestin1-Bcl-2信號(hào)通路起到主要作用。該通路下游Bcl-2在調(diào)控細(xì)胞凋亡基因中起到至關(guān)重要的作用，是重要的抗凋亡基因，能夠起到抑制細(xì)胞凋亡和增殖的作用，Bax是與Bcl-2基因功能完全相反的典型促凋亡蛋白。Bcl-2與Bax分別位于線粒體外膜和線粒體膜，故而其調(diào)控凋亡主要作用在線粒體水平，兩者保持相對(duì)平衡，一旦比例失衡則會(huì)引起T淋巴細(xì)胞凋亡缺陷，則可能引起腸道發(fā)生慢性炎癥〔9〕。DOR是跨膜G-蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)廣泛存在于神經(jīng)及免疫系統(tǒng)。β-arrestin1是一種具有多種生物功能的可溶蛋白質(zhì)，在GPCR信號(hào)通路中作為起始信號(hào)分子，發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。其分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，是細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)間的信號(hào)傳遞分子，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)參與GPCR的內(nèi)化、脫敏，終止GPCR信號(hào)通路，參與T淋巴細(xì)胞活化過(guò)程〔10〕。此外，能夠發(fā)揮抗凋亡基因作用的Bcl-2即作為靶基因直接受到β-arrestin1的調(diào)控?；罨腄OR信號(hào)誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的β-arrestin1信號(hào)向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而使組蛋白乙?；竝300到p27，與cfos增強(qiáng)啟動(dòng)子組蛋白H4乙酰化和Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，從而抑制UC腸道黏膜CD4+T細(xì)胞凋亡〔11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，潰瘍性結(jié)腸炎大鼠DOR-β-arrestin1-Bcl-2信號(hào)通路異常，存在過(guò)度表達(dá)的Bcl-2抗凋亡蛋白，CD4+T淋巴細(xì)胞在腸道組織中的過(guò)度聚集，蘭茵鳳揚(yáng)化濁解毒方可能通過(guò)調(diào)控UC大鼠DOR-β-arrestin1-Bcl-2信號(hào)通路，從而抑制Bcl-2基因的過(guò)度表達(dá)，有效減少腸道組織中CD4+T淋巴細(xì)胞的過(guò)度聚集，從而起到治療UC的目的。

經(jīng)查閱古籍，中醫(yī)本沒(méi)有UC的病名，但是根據(jù)其典型臨床表現(xiàn)，在中醫(yī)病名中，UC可定義為“久痢”、“腸澼”、“休息痢”等疾病范疇。中國(guó)古代醫(yī)學(xué)大家多認(rèn)為本病乃是起于濕阻，平素飲食礙胃，情志失調(diào)皆可為病因。本虛標(biāo)實(shí)，病機(jī)錯(cuò)雜為UC的主要發(fā)病特點(diǎn)。但通過(guò)長(zhǎng)期大量的臨床觀察，可發(fā)現(xiàn)本病的基礎(chǔ)病機(jī)是濁毒內(nèi)蘊(yùn)，也是本病纏綿難愈的關(guān)鍵因素。濁毒為病的機(jī)制可歸納為“易耗氣傷血、由血入絡(luò)，易停滯氣機(jī)、膠滯不分，易積累成形、敗壞臟腑”等三易四性的特點(diǎn)〔12〕。本病初期實(shí)證居多，濁毒壅結(jié)于腸，致氣血搏結(jié)，腸絡(luò)受損，血癰肉潰化膿，本期當(dāng)以化濁解毒為主給予治療;后期及緩解期多虛實(shí)夾雜證或虛證，在祛除濁毒之邪的同時(shí)兼顧補(bǔ)虛。雖然每個(gè)階段的治法有異，但以化濁解毒為基礎(chǔ)治法貫穿治療過(guò)程的始終。雖然本病病位位屬大腸，但是與脾胃生理功能關(guān)系密切。UC在臨床中的典型癥狀以腹痛、腹瀉、里急后重和黏液膿血便為主，常常伴隨體重減輕、嘔吐，偶見(jiàn)關(guān)節(jié)炎和虹膜睫狀體炎等其他病變。而蘭茵鳳揚(yáng)化濁解毒方的方義便是以藿香、佩蘭芳香醒脾、脾悅化濁止嘔，調(diào)理氣機(jī)，鳳尾草味苦性寒涼，有清熱利濕，涼血止血，解毒止痢之功，飛揚(yáng)草亦酸寒，除清熱解毒利濕，又具收斂之功，四藥合功，共奏化濁解毒之效而為君藥;茵陳本性寒，有清熱利濕的作用，現(xiàn)代藥理研究又因?yàn)槠鋼]發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌等有明顯的抑制作用，故佐助化濁解毒之力;地榆苦寒清熱，入血分而涼血止血，散血熱而療瘡解毒，祛瘀生新，配合烏梅、石榴皮治療赤白下痢，不僅能收斂抗菌，又能抗炎止血，涼血澀腸;仙鶴草苦澀性平，除涼血止血有奇效外，亦能健脾補(bǔ)虛和胃，作健脾止痢之效;白芍調(diào)和血?dú)?、緩急止?佛手、厚樸理氣則后重自除;兒茶生肌斂瘡。諸藥合用，濁邪化、毒邪清，氣血調(diào)和、臟腑有序而諸癥愈。

本研究表明，經(jīng)蘭茵鳳揚(yáng)化濁解毒方治療后，大鼠體質(zhì)量、糞便性狀、黏液膿血便等一般臨床情況均得到有效改善，鏡下結(jié)腸黏膜亦得到較好恢復(fù)，其中DOR、β-arrestin1及Bcl-2 mRNA在本實(shí)驗(yàn)中的表達(dá)水平有明顯下降。因此，蘭茵鳳揚(yáng)化濁解毒方可能通過(guò)調(diào)控DOR-β-arrestin1-Bcl-2信號(hào)通路中異?；罨h(huán)節(jié)的表達(dá)，增強(qiáng)腸道黏膜中T細(xì)胞的凋亡，恢復(fù)腸道免疫穩(wěn)態(tài)而起到治療UC目的。