基因突變與中國原發(fā)性骨髓纖維化臨床特征及預(yù)后

張正玲 魏 巍 潘 靜 孫園園 艾麗梅 (錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，遼寧 錦州 121001)

ph陰性骨髓增殖性腫瘤(MPN)的典型代表包括真性紅細(xì)胞增多癥(PV)、原發(fā)性血小板增多癥(ET)和原發(fā)性骨髓纖維化(PMF)〔1〕。許多研究結(jié)果表明，疾病進(jìn)展和急性髓系白血病(AML)轉(zhuǎn)化仍然是PMF患者預(yù)后不良的重要原因及治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)〔2～5〕。JAK2V617F和MPL515L是PMF患者最常見的常規(guī)分子改變事件，目前已被作為診斷和治療的依據(jù)納入新的PMF診斷標(biāo)準(zhǔn)〔6～8〕。最新研究發(fā)現(xiàn) CALR突變常見于發(fā)生在JAK2突變或MPL突變陰性的PMF患者中〔9～12〕。研究表明，90%以上的 PV 患者，50%～70%的ET或PMF患者可檢測到攜帶JAK2基因突變〔1，13～16〕;4%的ET 和8%PMF 患者攜帶有MPL515 基因突變〔17〕;15%～32%ET和25%～35%的PMF患者可見有 CALR-exon9插入或缺失突變〔18，19〕。但目前研究還沒能完全解釋攜帶何種基因突變的PMF患者更容易在治療過程中出現(xiàn)疾病進(jìn)展并最終導(dǎo)致不良預(yù)后〔16〕。國際上既往研究關(guān)于JAK2/CALR/MPL基因突變對PV、ET和PMF的臨床特征、生存時(shí)間情況和繼發(fā) AML 影響的研究資料較多〔2，3，20〕，但有關(guān) JAK2/CALR/MPL基因突變在中國PMF患者的特征及疾病進(jìn)展預(yù)后中作用的報(bào)道較少。本研究在Bai等〔21～23〕研究前期工作的基礎(chǔ)上，分析中國PMF患者JAK2/CALR/MPL基因突變與PMF臨床特征和預(yù)后的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 病例選擇 回顧性分析1983年8月至2014年11月就診于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院，年齡＞18歲的PMF患者175例，男79例，女96例，中位年齡55(18～83)歲。PMF和AML的診斷標(biāo)準(zhǔn)均嚴(yán)格依據(jù)2008年世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)〔13〕。所有患者通過門診隨訪、電話隨訪或隨訪信件的方式進(jìn)行信息確認(rèn)。本研究獲得錦州醫(yī)科大學(xué)及中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 等位基因特異性PCR檢測JAK2V617F 應(yīng)用巢式等位基因特異性PCR檢測JAK2V617F突變情況。引物如下:P2:5'-CCTCAGAACGTTGATGGCA-3'，P2r:5'-ATTGCTTTCCTTTTTCACAAGA-3'，Pnf: 5'-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATG-3'，Pmr:5'-GTTTTACTTACTCTCGTCTCCACAAAA-3'。PCR 產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳后于紫外燈下分析，產(chǎn)物為453 bp、279 bp和 229 bp 3種類型。279 bp為JAK2V617F突變型產(chǎn)物，229 bp為野生型產(chǎn)物。當(dāng)DNA樣本含量較低時(shí)，先用引物 P1:5'-GATCTCCATATTCCAGGCTTACACA-3'和P1r:5'-TATTGTTTGGGCATTGTAACCTTCT-3'預(yù)擴(kuò)增獲得521 bp大小的產(chǎn)物，再取1 μl預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用上述巢式PCR進(jìn)行二次擴(kuò)增〔24〕。

1.3 Sanger測序 采用Sanger進(jìn)行突變基因的序列測序檢測JAK2外顯子12，CALR外顯子9，MPL外顯子10編碼序列突變。PCR擴(kuò)增體系為 50 μl，含200 ng模板DNA、上下游引物各200 nmol，剩余體積用Platinum PCR Super Mix(Invitrogen)補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增條件為CALR:95℃ 5 min;94℃ 30 s，67℃ 30s(每循環(huán)降低 1℃)，72℃ 30 s，10 個(gè)循環(huán);94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，29個(gè)循環(huán);72℃ 10 min;10℃保存。MPL和JAK2:95℃ 10 min;95℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán);72℃ 10 min;JAK2V617F:95℃ 5 min;95℃30 s，54℃ 25 s，72℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán);72℃ 10 min，PCR產(chǎn)物由北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行純化測序，測序結(jié)果應(yīng)用DNASIS MAX軟件進(jìn)行分析，所有突變樣品用正?；蛐蛄羞M(jìn)行證實(shí)。

1.4 分組 根據(jù)臨床診斷和基因突變類型將PMF患者分為 CALR突變的 PMF(CALR組)18例;JAK2V617F突變的PMF(JAK2V167組)88例;CALR/JAK2/MPL基因突變?nèi)?三陰組)的PMF 64例共3組(MPL突變僅5例，未統(tǒng)計(jì))。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 PMF患者總生存(OS)時(shí)間定義為診斷PMF至死亡或末次隨訪的時(shí)間。應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析;非正態(tài)分布數(shù)據(jù)應(yīng)用中位數(shù)(范圍)描述。定性變量用Fisher確切概率法;連續(xù)變量用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，影響PMF生存的危險(xiǎn)因素，應(yīng)用多因素Cox回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 PMF的總體臨床特征 175例PMF患者中，中位隨訪時(shí)間5(1～25)年，預(yù)計(jì)生存時(shí)間15.2年，共34例死亡，死亡率為19.4%。175例患者年齡＞60歲49例(28.0%)，平均白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)為(13.13±12.76)×109/L，平均血紅蛋白(Hb)為(107.98±27.30)g/L，平均血小板計(jì)數(shù)為(473.87±320.31)×109/L。繼發(fā)AML的發(fā)生率為13.7%(34/175)，染色體異常發(fā)生率為7.4%(13/175)，Hb＜100 g/L 69例(39.4%)，WBC＞11×109/L 25 例(14.3%)，血小板＞1 000×109/L 24 例(13.7%)，外周幼稚細(xì)胞＞1%106例(43.4%)。

12例單用羥基脲治療，18例應(yīng)用干擾素加羥基脲治療，16例單用干擾素治療，127例應(yīng)用烷化劑、沙利度胺、雄激素等的治療，2例應(yīng)用中藥(具體不詳)治療。24例(13.7%)PMF患者轉(zhuǎn)化為AML。

2.2 JAK2V617F突變、CALR突變或基因突變?nèi)幣cPMF患者臨床特征相關(guān)性 與JAK2V617F組比較，CALR組血小板稍高，Hb含量較低，WBC較低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);三陰組表現(xiàn)為較低的Hb含量和較低的WBC(均P＜0.001);對比三陰組，CALR組有較高的血小板數(shù)，較高的Hb含量及較高的WBC(P＜0.05)。各組異常染色體核型發(fā)生率、白血病轉(zhuǎn)化率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。三陰組死亡率明顯高于JAK2V617F組和 CALR組(P＜0.05)，JAK2V617F組與CALR組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.804)，見表 1。

2.3 基因突變狀態(tài)與PMF患者的生存情況 基因突變?nèi)幍腜MF患者生存最差。CALR組生存時(shí)間最長，為14.778年，JAK2V617F組次之，為14.757年，三陰組最短，為10.829年(圖1)。相對JAK2V617F組、CALR組，三陰組生存時(shí)間較差(P=0.011，0.049);JAK2V617F組較CALR組生存差，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.734)。

Cox多因素分析顯示，年齡＞60歲(OR=0.270，95%CI:0.135～0.539，P＜0.01);Hb＜100 g/L(OR=0.986，95%CI:0.973～0.999，P=0.042);WBC＞11×109/L(OR=2.377，95%CI:1.110～5.091，P=0.026);外周血幼稚細(xì)胞＞1%(OR=0.844，95%CI:0.570～1.250，P=0.048)和基因突變?nèi)?OR=3.314;95%CI:1.657～6.626，P=0.001)是影響 PMF生存的不良危險(xiǎn)因素。

表1 JAK2V617F突變、CALR突變、基因突變?nèi)幣cPMF的相關(guān)性()

表1 JAK2V617F突變、CALR突變、基因突變?nèi)幣cPMF的相關(guān)性()

臨床特征 JAK2V617F組(n=88) CALR組(n=18) 三陰組(n=64) P值JAK2/CALR JAK2/三陰 CALR/三陰Hb含量(g/L) 117.17±24.15 109.17±18.20 95.36±28.41 0.120 ＜0.01 0.017 WBC(×109/L) 18.02±15.38 12.58±8.51 7.19±5.40 0.149 ＜0.01 0.012血小板計(jì)數(shù)(×109/L) 524.03±158.34 664.22±236.87 368.28±173.89 0.322 0.067 0.021染色體異常率〔n(%)〕 6(6.8) 1(5.6) 5(7.8) 0.854 0.819 0.749白血病轉(zhuǎn)化率〔n(%)〕 9(10.2) 1(5.6) 13(20.3) 0.600 0.076 0.109死亡率〔n(%)〕 12(13.6) 2(11.1) 19(29.7) 0.804 0.014 0.048

圖1 不同基因突變類型PMF患者的生存曲線

3 討論

Tefferi等〔25〕研究表明，CALR基因突變的PMF患者表現(xiàn)為較高的血小板數(shù)，較低的Hb計(jì)數(shù)和較好的生存時(shí)間〔18，19，26，27〕?；蛲蛔?nèi)幍?PMF 患者則具有較差的生存和較高的白血病轉(zhuǎn)化率〔9，25，28〕。

本研究中不同基因突變的患者間生存情況與Tefferi等〔9，25，28〕的研究結(jié)果類似，即在中國 PMF 患者中，基因突變?nèi)幍腜MF患者預(yù)后最差，故基因突變?nèi)幍腜MF患者中可能存在其他基類型的基因突變，應(yīng)加強(qiáng)基因突變?nèi)幍腜MF患者的干預(yù)和治療強(qiáng)度。

本研究中，MPL突變在PMF患者中發(fā)生較低〔16〕，無法分析其與預(yù)后的相關(guān)性，故未納入統(tǒng)計(jì)。原因可能有以下兩點(diǎn):一是所選取的病例數(shù)較少，存在一定偏差;二是MPL突變率較低可能是中國PMF患者的另一特征，下一步將擴(kuò)大病例數(shù)進(jìn)一步研究分析MPL突變對PMF患者臨床及實(shí)驗(yàn)室特征的影響。

總之，將JAK2/CALR/MPL基因突變結(jié)合WHO標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)行PMF診斷會更加精細(xì)，且基因突變檢測對判斷PMF預(yù)后及明確其發(fā)病的分子機(jī)制至關(guān)重要。下一步將進(jìn)行JAK2V617F突變負(fù)荷檢測，進(jìn)一步明確不同突變負(fù)荷對PMF患者臨床特征、疾病轉(zhuǎn)化與預(yù)后的影響。