好氧反硝化技術(shù)處理水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水研究進(jìn)展

黃志濤， 江玉立， 宋協(xié)法

(中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島 266003)

水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中部分飼料在魚類消化、吸收等代謝過程中轉(zhuǎn)化為氨氮排泄到養(yǎng)殖環(huán)境，產(chǎn)生的殘飼、糞便也會(huì)在微生物作用下礦化為氨，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮。循環(huán)水養(yǎng)殖過程中的生物過濾環(huán)節(jié)可以將水體中毒性較高的氨氮和亞硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化成毒性較低的硝酸鹽氮，引起水體中的硝酸鹽積累，其質(zhì)量濃度可達(dá)100 mg/L以上，甚至是500 mg/L以上[1]。研究表明，硝酸鹽氮對(duì)于養(yǎng)殖對(duì)象的毒害作用比同質(zhì)量濃度的氨氮和亞硝酸鹽氮要低，但高質(zhì)量濃度的硝酸鹽氮仍會(huì)導(dǎo)致魚類生長(zhǎng)緩慢，存活率降低，免疫力下降[2-6]。含有高質(zhì)量濃度硝酸鹽氮養(yǎng)殖廢水的排放，是自然環(huán)境水體富營(yíng)養(yǎng)化的重要原因之一，因而應(yīng)將循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中硝酸鹽氮的質(zhì)量濃度控制在合理范圍內(nèi)。

生物脫氮技術(shù)是目前處理水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的有效方式之一。實(shí)際生產(chǎn)中，養(yǎng)殖水體中的溶氧一般保持在4～8 mg/L。而傳統(tǒng)反硝化理論認(rèn)為氧氣的存在會(huì)抑制反硝化酶活性，只有在缺氧或兼性厭氧的條件下反硝化酶才具有活性，生物反硝化過程才能進(jìn)行。20世紀(jì)80年代，Robertson等[7]報(bào)道了好氧反硝化細(xì)菌和好氧反硝化酶系的存在，為水產(chǎn)養(yǎng)殖在有氧條件下去除硝酸鹽提供了一種嶄新的思路。近年來(lái)，隨著對(duì)生物脫氮研究的深入，好氧反硝化細(xì)菌的研究日益增多，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水處理方面應(yīng)用研究較少。

本文介紹了好氧反硝化細(xì)菌的作用機(jī)理，分析了好氧反硝化細(xì)菌的影響因素，重點(diǎn)介紹了好氧反硝化細(xì)菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水處理中的應(yīng)用現(xiàn)狀，指出存在的問題并對(duì)其前景進(jìn)行展望，以期為水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水反硝化的應(yīng)用和推廣提供理論參考。

1 好氧反硝化作用機(jī)理探討

近年來(lái)，不同學(xué)者對(duì)于好氧反硝化作用機(jī)理存在不同的觀點(diǎn)，本文從微環(huán)境、生物化學(xué)和微生物3個(gè)方面對(duì)近幾年國(guó)內(nèi)外學(xué)者所做的一些研究成果進(jìn)行闡述。

1.1 微環(huán)境理論

微環(huán)境理論主要側(cè)重于從物理角度闡述好氧反硝化作用機(jī)理[8-9]，認(rèn)為由于氧氣的擴(kuò)散作用，微生物絮體內(nèi)部或者生物膜表面會(huì)產(chǎn)生溶氧的質(zhì)量濃度梯度，即微生物絮體表面溶氧的質(zhì)量濃度較高，好氧硝化細(xì)菌發(fā)生反應(yīng)，當(dāng)深入絮體內(nèi)部時(shí)，氧氣的傳遞受到阻礙，其微環(huán)境為缺氧區(qū)，厭氧反硝化反應(yīng)占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。當(dāng)微生物反應(yīng)池內(nèi)溶氧質(zhì)量濃度不高時(shí)，會(huì)使缺氧環(huán)境的比例有所升高，有利于反硝化作用的進(jìn)行[10]。實(shí)際生產(chǎn)中，由于外部環(huán)境多變，微生物群落復(fù)雜以及電子傳遞不均勻等因素，使得在微生物絮體內(nèi)或者生物膜表面產(chǎn)生多種微環(huán)境。

1.2 生物化學(xué)機(jī)理

1.3 微生物理論

1.3.1 協(xié)同呼吸理論

協(xié)同呼吸理論[13]認(rèn)為，在好氧反硝化過程中，硝酸鹽和氧氣均可作為電子受體參與反應(yīng)，細(xì)胞色素c和細(xì)胞色素aa3之間電子傳輸過程中的“瓶頸”可被克服，因而電子流就可以同時(shí)傳輸給反硝化酶和氧氣，故反硝化就可以在好氧環(huán)境中發(fā)生(圖1)。Huang等[14]也認(rèn)為，氧氣和硝酸鹽氮同時(shí)存在時(shí)，反硝化作為輔助電子傳遞途徑，是對(duì)有氧呼吸的補(bǔ)充，可防止煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)的大量積累。此外，細(xì)胞色素的氧化還原水平會(huì)控制電子流向不同的細(xì)胞色素，以確定電子是否能夠發(fā)生反硝化。Wilson等[15]提出的好氧反硝化過程中電子傳遞見圖1，反硝化細(xì)菌可以將電子從被還原的物質(zhì)傳遞給O2，同時(shí)也可通過硝酸鹽還原酶將電子傳遞給硝酸根。

注：Nar為硝酸鹽還原酶；Nir為亞硝酸鹽還原酶；Nor為一氧化氮還原酶；Nos為一氧化二氮還原酶

1.3.2 好氧反硝化酶作用

好氧反硝化被認(rèn)為是一個(gè)涉及4種酶，即硝酸鹽還原酶(Nar)、亞硝酸鹽還原酶(Nir)、一氧化氮還原酶(Nor)和一氧化二氮還原酶(Nos)的4步復(fù)雜生化還原反應(yīng)。從好氧反硝化酶系角度闡述好氧反硝化機(jī)理開始于對(duì)泛養(yǎng)硫球Thiosphaerapantotropha[16](現(xiàn)更名為脫氮副球菌Paracoccusdenitrifications)的研究，在T.pantotropha內(nèi)包含著膜內(nèi)硝酸鹽還原酶(Nar)和周質(zhì)硝酸鹽還原酶(Nap)，在好氧條件下，Nap優(yōu)先被還原，而在厭氧條件下，Nap的活性被抑制，Nar活躍，被優(yōu)先利用。Bell等[17]利用Nar對(duì)含氮化合物在不同條件下敏感性進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在厭氧環(huán)境下，90%的Nar活性被抑制，而在好氧的環(huán)境下，好氧生長(zhǎng)細(xì)胞被抑制了25%。Nir主要有2種，一種是人們熟知的細(xì)胞色素cd1，由Nirs基因編碼；另一種是Nir，位于外周胞質(zhì)，是一種可溶性含銅酶，由Nirk基因編碼。劉興等[18]研究銅綠假單胞菌YY24發(fā)現(xiàn)，該菌存在膜結(jié)合Nar，Nir類型為細(xì)胞色素cd1型Nir。Nos已在P.stutzeri、P.denitrifications等細(xì)菌中分離提純，其部分特征已被確定由Nor CB基因編碼[19]。好氧反硝化菌的Nos是一種含銅蛋白，位于膜外周質(zhì)中[20]。Bell等[17]認(rèn)為，在氧氣存在條件下脫氮副球菌細(xì)胞Nos具有活性，且能將NO、N2O兩種氣體同時(shí)還原。硝酸鹽降解過程是因?yàn)楹醚醴聪趸w內(nèi)依次產(chǎn)生Nar，Nir，Nor和Nos，最終生成氮?dú)狻?/p>

2 好氧反硝化影響因素

影響好氧反硝化反應(yīng)的因素有碳氮比(C/N)、溶氧(DO)、碳源、溫度、pH等，但不同的菌株種類、好氧反硝化反應(yīng)器結(jié)構(gòu)以及環(huán)境調(diào)控措施使得它們的影響能力各不相同。近幾年的研究表明，在水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水處理中，反硝化主要受碳源、溶氧和碳氮比等因素的影響[12,14,21]。

2.1 碳源

碳源是細(xì)菌生長(zhǎng)過程中必不可少的能量來(lái)源，碳源越充足，好氧反硝化速率越快，總氮去除率也越高[21]。孫慶花等[22]從海洋沉積物中分離出一株好氧反硝化細(xì)菌，即克雷伯氏菌Klebsiellasp.，發(fā)現(xiàn)以檸檬酸三鈉為碳源時(shí)，硝酸鹽氮的去除率為90.27%，且無(wú)亞硝酸鹽氮積累。Hamlin等[23]利用甲醇、乙酸、葡萄糖、水解的淀粉作為反硝化的碳源對(duì)西伯利亞鱘魚養(yǎng)殖水體進(jìn)行凈化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)4種碳源均能有效地將硝酸鹽氮質(zhì)量濃度從11～57 mg/L降至接近0的質(zhì)量濃度，在不考慮碳源限制的條件下，每天最大的反硝化率為670～680 g/m3。白潔等[24]從膠州灣沉積物中分離出1 株異養(yǎng)硝化—好氧反硝化菌株Zobellellasp B307，在最優(yōu)條件下考察其在單一和混合氮源中的脫氮效果，發(fā)現(xiàn)最佳碳源為丁二酸鈉，在最佳條件下對(duì)氨氮和硝酸鹽氮的去除率分別達(dá)到97.67%和94.39%。Duan等[25]研究發(fā)現(xiàn)好氧反硝化細(xì)菌VibriodiabolicusSF16的最佳碳源為乙酸鈉。Bernat等[26]利用活性污泥處理無(wú)碳源廢水，脫氮率為1.54 mg/L，而處理投加醋酸鈉的廢水，脫氮率達(dá)到22.50 mg/L，說(shuō)明好氧反硝化細(xì)菌外源呼吸比內(nèi)源呼吸效率高?？梢姾醚醴聪趸?xì)菌最適宜的碳源不盡相同，這是由于碳源結(jié)構(gòu)及分子量的差異導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)和脫氮效果的不同。

2.2 溶氧

溶氧通過抑制反硝化酶的合成、活性或者與硝酸鹽競(jìng)爭(zhēng)電子供體等途徑影響好氧反硝化反應(yīng)進(jìn)程，對(duì)細(xì)菌的反硝化性能至關(guān)重要[27]。邵晴等[28]分離的好養(yǎng)反硝化細(xì)菌A1，在溶氧為5 mg/L時(shí)，對(duì)亞硝酸鹽的去除率高達(dá)99%，且反硝化主要發(fā)生在菌種生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期。Huang等[14]認(rèn)為溶氧是細(xì)菌進(jìn)行好氧反硝化的關(guān)鍵因素，當(dāng)溶氧為5 mg/L時(shí)，好氧反硝化細(xì)菌Citrobacterdiversus的反硝化速率最高，溶氧的升高和降低都會(huì)造成好氧反硝化速率的下降，原因可能是溶氧在閾值以上時(shí)氧氣對(duì)于反硝化酶有抑制作用。溶氧閾值[29]是區(qū)分厭氧反硝化與好氧反硝化的主要標(biāo)志之一，該值越高，表明菌株對(duì)氧的耐受能力越強(qiáng)，即在高溶氧條件下仍表現(xiàn)出良好的反硝化能力。

2.3 碳氮比

水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水通常是貧營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，所以需要額外添加碳源，因而碳氮比(C/N)在反硝化過程中起著重要作用。好氧反硝化的效率隨C/N的增加而提高，C/N的降低會(huì)減少反硝化基因表達(dá)，沒有足夠的碳源來(lái)合成反硝化酶，影響菌體生長(zhǎng)以及硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮的去除[29]。Guo等[30]對(duì)好養(yǎng)反硝化細(xì)菌HNR進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)表明，在C/N為13時(shí)具有最大反硝化率。降低碳氮比，會(huì)使反硝化反應(yīng)過程不完全，導(dǎo)致水體中硝酸鹽氮的積累[31]。Van等[32]以乙酸為反硝化碳源實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)C/N為2∶1或3∶1時(shí)，亞硝酸鹽氮完全還原成氣體，而當(dāng)C/N下降為1∶1時(shí)，僅有50%硝酸鹽氮被還原。除此之外，也有研究發(fā)現(xiàn)，某些特定的菌株，其C/N的變化范圍較小，在最佳C/N值時(shí)能夠誘導(dǎo)菌株釋放足夠的反硝化酶，繼續(xù)增加碳源，其反硝化活性不會(huì)增加[33]。梁書城[34]通過改變碳源質(zhì)量濃度調(diào)整C/N分別為5、10、15、20，發(fā)現(xiàn)在碳源充足的前提下，DL-23菌株的反硝化能力在C/N 10到15之間均表現(xiàn)出了相似的脫氮效果，繼續(xù)增加碳源，硝酸鹽氮去除能力并未增強(qiáng)。

3 好氧反硝化反應(yīng)器處理養(yǎng)殖廢水應(yīng)用

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)作為近年來(lái)流行的養(yǎng)殖方式，其系統(tǒng)內(nèi)硝酸鹽的積累可達(dá)400～500 mg/L[38]，因此許多研究者為去除循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的硝酸鹽氮而建立好氧反硝化反應(yīng)器。Kaiser等[39]在封閉循環(huán)式魚類養(yǎng)殖虹鱒系統(tǒng)中建立一種轉(zhuǎn)盤式生物過濾器，通過添加可水解玉米纖維碳源來(lái)促進(jìn)生物濾池內(nèi)好氧反硝化細(xì)菌進(jìn)行反硝化，運(yùn)行118 d，硝酸鹽氮由120 mg/L下降至10 mg/L后趨于穩(wěn)定。Yossi等[40]在金頭鯛(Sparusaurata)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中利用海藻酸鹽凝膠微球建立移動(dòng)床反應(yīng)器(MBB)，以淀粉為碳源處理養(yǎng)殖排放污水，最大硝酸鹽氮脫氮速率可達(dá)2.7 mg/(h·L)。

4 固定化好氧反硝化細(xì)菌處理水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水

許多學(xué)者還將好氧反硝化細(xì)菌簡(jiǎn)單組合構(gòu)建成微生物制劑，相對(duì)于純菌的處理工藝，微生物制劑的混菌降解能力增強(qiáng)。陳進(jìn)斌等[44]從天津某海水養(yǎng)殖場(chǎng)底泥中分離篩選3株具有高效好氧反硝化特性的微生物，通過正交試驗(yàn)確定三株菌的最適比例是3∶2∶1，最適比例的菌劑組合在12 h內(nèi)對(duì)海水養(yǎng)殖廢水中硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮的去除率分別為60.45%和67.44%。杜剛等[45]利用PVA和SA固定由光合細(xì)菌、放線菌、硝化菌、好氧反硝化菌以及枯草芽孢桿菌組合成的混合菌群用于養(yǎng)殖污水脫氮處理，結(jié)果表明氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮的去除率分別為85.0%，87.3%，79.3%。不同功能的微生物固定在同一個(gè)載體上，能夠構(gòu)建成一個(gè)微型人工生態(tài)系統(tǒng)，菌種之間協(xié)同作用進(jìn)行水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水脫氮，具有良好的去除效果。因此，在水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水處理中可以將反硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌按一定比例混合，從而加快脫氮處理效果，實(shí)現(xiàn)在同一個(gè)反應(yīng)器中同步硝化反硝化。

5 外加碳源的好氧反硝化處理水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水

近年來(lái)，許多學(xué)者利用新型的可生物降解聚合物作為反硝化碳源和生物膜載體去除養(yǎng)殖廢水中硝酸鹽氮。Boley[48]等利用聚己內(nèi)酯(PCL)、聚-β-羥丁酸(PHB)和二羧酸二元醇(Bionolle)這3種可生物降解材料作為生物膜載體和反硝化碳源，出水硝酸鹽氮質(zhì)量濃度穩(wěn)定在0.1 mg/L以下，而亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度也可以維持在0.05 mg/L以下，并未出現(xiàn)積累。張?zhí)m河等[49]利用聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)作為固體碳源和生物膜載體，其連接的固相反硝化反應(yīng)器能顯著降低循環(huán)水系統(tǒng)中積累的硝酸鹽，并維持在較低水平(小于10 mg/L)。

6 結(jié)論與展望

好氧反硝化作為一種新型的脫氮工藝，具有技術(shù)簡(jiǎn)單、占地小、能夠?qū)崿F(xiàn)硝化與反硝化同時(shí)進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)，被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。目前越來(lái)越多的好氧反硝化細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)，但對(duì)于好氧反硝化技術(shù)的研究仍停留在試驗(yàn)階段，雖然有不少學(xué)者將好氧反硝化菌應(yīng)用到反應(yīng)器中，但實(shí)際應(yīng)用較少。今后的研究重點(diǎn)應(yīng)該在以下幾個(gè)方面：1)篩選分離耐高氨氮、耐高溶氧、耐鹽等特性的好氧反硝化細(xì)菌，探究影響好氧反硝化細(xì)菌脫氮性能的因素，并結(jié)合水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)適合水產(chǎn)養(yǎng)殖的反應(yīng)器和運(yùn)行模式，為其在海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)。2)利用分子生物學(xué)等技術(shù)，深入研究好氧反硝化反應(yīng)機(jī)理，建立好氧反硝化動(dòng)力學(xué)模型，利用基因重組等分子生物學(xué)技術(shù)強(qiáng)化功能基因，對(duì)好氧反硝化細(xì)菌種群進(jìn)行鑒定和跟蹤，提高對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水的脫氮效率。3)生物固定化技術(shù)可以提高水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中菌種的密度，防止流速過快、菌種流失，阻礙養(yǎng)殖廢水中的有毒物質(zhì)對(duì)菌株的毒害，故應(yīng)對(duì)固定化微生物技術(shù)進(jìn)行深入研究，并將其應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)踐中，高效、經(jīng)濟(jì)地實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖廢水脫氮。

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