大鼠骨骼肌挫傷后bFGF和MMP-1陽(yáng)性細(xì)胞率比值與損傷時(shí)間的關(guān)系研究

柳丹鳳，曾達(dá)，李林峰，田甜，林偉，李雪榕，劉敏

(1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041;2.廣東南天司法鑒定所，廣東 深圳 518045)

骨骼肌挫傷在法醫(yī)工作中較常見(jiàn)，但對(duì)其損傷時(shí)間的推斷依然是法醫(yī)學(xué)研究及實(shí)踐中的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一。近些年的研究發(fā)現(xiàn)在骨骼肌挫傷后許多生化指標(biāo)的表達(dá)變化具有時(shí)序性，比如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和金屬蛋白酶-1(metal matrix proteinase-1，MMP-1)，在創(chuàng)傷愈合過(guò)程中表達(dá)明顯增加并參與組織修復(fù)[1-7]。既往研究大多只觀察單一生化指標(biāo)的表達(dá)情況，同一表達(dá)水平往往可對(duì)應(yīng)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，因此僅根據(jù)單一生化指標(biāo)難以準(zhǔn)確推測(cè)損傷時(shí)間。董賀文等[8]認(rèn)為采用先后不同時(shí)間表達(dá)的兩個(gè)生化指標(biāo)的表達(dá)比值并結(jié)合其各自變化規(guī)律，可為腦震蕩傷提供損傷時(shí)間區(qū)間。骨骼肌挫傷時(shí)間的推斷是否可采用類似的方法值得研究。本實(shí)驗(yàn)在建立大鼠骨骼肌挫傷模型基礎(chǔ)上，對(duì)損傷骨骼肌組織的bFGF和MMP-1進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)二者在傷后不同時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)情況，觀察bFGF和MMP-1陽(yáng)性細(xì)胞率比值的時(shí)序性變化，以期為骨骼肌損傷時(shí)間的推斷提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

本實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。選擇健康成年SD大鼠65只，雌雄不限，體質(zhì)量180～200 g，由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組(60只)和對(duì)照組(5只)。根據(jù)處死時(shí)間不同，將實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分為0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、7 d、10 d和14 d共12組，每組5只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備及樣本處理 實(shí)驗(yàn)時(shí)用0.3%戊巴比妥鈉按1 mL/100 g劑量腹腔注射麻醉，麻醉生效后，將大鼠俯臥位固定于鼠板，左后肢剪毛備皮后稍外旋，使小腿后肌群置于脛腓骨內(nèi)側(cè)。參照Marmarou的自由落體打擊裝置，將500 g砝碼于70 cm高度自由下落致左側(cè)骨骼肌挫傷。實(shí)驗(yàn)組大鼠分別于傷后0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、7 d、10 d和14 d脫頸椎處死。采取大鼠左后肢挫傷中心處肌肉，于4%多聚甲醛溶液中固定48 h。取標(biāo)本大小為1 cm×0.6 cm×0.4 cm，脫水、包埋，常規(guī)切片后保存于4 ℃冰箱。對(duì)照組大鼠不造成損傷，常規(guī)飼養(yǎng)24 h后脫頸椎處死，取材部位同為左后肢骨骼肌。

1.2.2 HE染色 取樣本石蠟切片并行常規(guī)HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察所取骨骼肌的病理學(xué)改變。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定 取樣本石蠟切片，免疫組織化學(xué)染色依照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，完成孵育、滴加SABC、顯色、復(fù)染、脫水和封片等步驟。一抗為兔抗大鼠bFGF多克隆抗體(BeacomBio公司，貨號(hào)：BIO171291)及兔抗大鼠MMP-1多克隆抗體(BeacomBio公司，貨號(hào)：BIO48658)，陰性對(duì)照以PBS緩沖液取代一抗。bFGF陽(yáng)性反應(yīng)判斷標(biāo)準(zhǔn)為骨骼肌細(xì)胞胞漿內(nèi)均勻分布棕黃色細(xì)小顆粒；MMP-1陽(yáng)性反應(yīng)判斷標(biāo)準(zhǔn)為骨骼肌細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)均勻分布棕黃色細(xì)小顆粒。每張切片先于低倍鏡下(×100)觀察陽(yáng)性反應(yīng)情況，后于高倍鏡下(×400)隨機(jī)選取5個(gè)視野照相并儲(chǔ)存。應(yīng)用Image pro plus 6.0圖像分析軟件對(duì)每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目和總細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率(陽(yáng)性細(xì)胞率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨骼肌組織病理學(xué)改變

對(duì)照組大鼠骨骼肌鏡下未見(jiàn)明顯異常。實(shí)驗(yàn)組大鼠傷后0.5～1 h可見(jiàn)骨骼肌局部出血、水腫。傷后3 h挫傷處骨骼肌局部出血、水腫、變性。傷后6 h部分骨骼肌細(xì)胞胞漿均質(zhì)化，橫紋不清；骨骼肌間質(zhì)水腫明顯，伴大量出血及灶性炎細(xì)胞浸潤(rùn)。傷后12 h～1 d，挫傷處骨骼肌胞漿進(jìn)一步均質(zhì)化，骨骼肌橫紋消失；間質(zhì)水腫明顯，見(jiàn)出血及部分炎細(xì)胞浸潤(rùn)。傷后2 d炎細(xì)胞浸潤(rùn)最為顯著，其后呈下降趨勢(shì)。傷后3 d挫傷處新生骨骼肌開(kāi)始出現(xiàn)，細(xì)胞核增多；間質(zhì)水腫減輕，出血減少。傷后4 d可見(jiàn)細(xì)胞中央肌細(xì)胞核增殖。傷后7～10 d新形成的肌細(xì)胞明顯增多，炎細(xì)胞基本消失；間質(zhì)已無(wú)出血及水腫。傷后14 d可見(jiàn)新生骨骼肌與周邊肌纖維融合(圖1)。

2.2 骨骼肌免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

2.2.1 bFGF在骨骼肌內(nèi)的表達(dá) 對(duì)照組大鼠骨骼肌內(nèi)未見(jiàn)bFGF陽(yáng)性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組大鼠骨骼肌挫傷3 h后開(kāi)始出現(xiàn)bFGF陽(yáng)性表達(dá)，表現(xiàn)為骨骼肌細(xì)胞胞漿外周和肌膜呈黃色或棕色改變，陽(yáng)性細(xì)胞率高于對(duì)照組(P<0.05)。其后陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多(胞核未見(jiàn)著色)，于傷后7 d陽(yáng)性細(xì)胞率達(dá)到峰值。隨時(shí)間延長(zhǎng)，陽(yáng)性表達(dá)逐漸減弱，至傷后14 d骨骼肌內(nèi)仍可見(jiàn)bFGF陽(yáng)性表達(dá)，其陽(yáng)性細(xì)胞率高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表1。

2.2.2 MMP-1在骨骼肌內(nèi)的表達(dá) 對(duì)照組大鼠骨骼肌內(nèi)未見(jiàn)MMP-1陽(yáng)性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組大鼠傷后0.5 h骨骼肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)MMP-1陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性反應(yīng)主要位于骨骼肌細(xì)胞胞漿及胞核，陽(yáng)性細(xì)胞率高于對(duì)照組(P<0.05)。其后MMP-1陽(yáng)性細(xì)胞率逐漸升高，于傷后3 d達(dá)到高峰。隨時(shí)間延長(zhǎng)，陽(yáng)性表達(dá)開(kāi)始減少，于傷后14 d骨骼肌細(xì)胞內(nèi)仍可見(jiàn)MMP-1陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞率高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表1。

表1 骨骼肌挫傷后不同時(shí)間bFGF、MMP-1陽(yáng)性細(xì)胞率

*P<0.05，與對(duì)照組比較；#P<0.05，與相鄰上一組比較。

2.3 bFGF與MMP-1陽(yáng)性細(xì)胞率比值變化情況

bFGF與MMP-1陽(yáng)性細(xì)胞率的比值呈現(xiàn)上升-峰值-下降的趨勢(shì)。骨骼肌挫傷后0.5 h～3 h因此期bFGF未見(jiàn)表達(dá)，bFGF與MMP-1陽(yáng)性細(xì)胞率的比值為0。3 h后挫傷區(qū)骨骼肌bFGF開(kāi)始表達(dá)，同時(shí)MMP-1陽(yáng)性細(xì)胞率繼續(xù)升高，二者陽(yáng)性細(xì)胞率比值開(kāi)始逐漸穩(wěn)定地升高但增幅緩慢，傷后3 d時(shí)比值為1.01。3 d后MMP-1的陽(yáng)性表達(dá)減少而bFGF的陽(yáng)性細(xì)胞率仍在增加，bFGF與MMP-1陽(yáng)性細(xì)胞率比值開(kāi)始快速地升高，至傷后7 d時(shí)達(dá)到峰值3.05。此后bFGF與MMP-1的陽(yáng)性細(xì)胞率均減少，二者陽(yáng)性細(xì)胞率比值開(kāi)始快速下降，至傷后14 d時(shí)降至1.18。見(jiàn)圖4。

2.4 相關(guān)性分析

根據(jù)表1結(jié)果，以骨骼肌挫傷后時(shí)間為橫坐標(biāo)，bFGF和MMP-1的陽(yáng)性細(xì)胞率及兩者比值分別作為縱坐標(biāo)，對(duì)二者的相關(guān)性進(jìn)行非線性擬合。bFGF與MMP-1的陽(yáng)性細(xì)胞率比值相關(guān)系數(shù)為0.662，具有顯著相關(guān)性(P=0.019)；而bFGF陽(yáng)性細(xì)胞率、MMP-1陽(yáng)性細(xì)胞率和骨骼肌挫傷后時(shí)間無(wú)顯著相關(guān)(bFGF：P=0.355；MMP-1：P=0.547)。

3 討論

3.1 骨骼肌挫傷后bFGF的表達(dá)

bFGF是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族中的一員，在健康骨骼肌纖維幾乎不表達(dá)，只有在骨骼肌損傷或大量運(yùn)動(dòng)后bFGF才大量表達(dá)并發(fā)揮其生物學(xué)功能。研究表明[2]bFGF在損傷組織局部表達(dá)增加，一方面可通過(guò)趨化作用使巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等聚集于損傷部位，另一方面可促進(jìn)新生血管的形成和成肌細(xì)胞的增殖(形成肉芽組織)，對(duì)損傷骨骼肌的愈合具有非常重要的作用。徐明明等[3]在骨骼肌急性鈍挫傷模型大鼠傷后第3、6、9、12、21天計(jì)算bFGF的平均光密度值，結(jié)果提示bFGF在傷后第3天開(kāi)始增高，6 d達(dá)到峰值，9 d后開(kāi)始逐漸下降。其他關(guān)于bFGF隨時(shí)間變化的研究也得到類似結(jié)論[4]。本實(shí)驗(yàn)中大鼠骨骼肌挫傷3 h后bFGF開(kāi)始表達(dá)，7 d后其陽(yáng)性細(xì)胞率達(dá)峰值，此后逐漸降低。與前述研究相比，本次研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌挫傷后bFGF開(kāi)始表達(dá)的時(shí)間提前，但bFGF隨損傷時(shí)間表達(dá)的總體變化規(guī)律與前述研究基本一致。不過(guò)因bFGF的陽(yáng)性細(xì)胞率對(duì)應(yīng)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，且本實(shí)驗(yàn)中bFGF的陽(yáng)性細(xì)胞率與骨骼肌挫傷后時(shí)間無(wú)顯著相關(guān)，因此單純依據(jù)bFGF陽(yáng)性細(xì)胞率的表達(dá)情況難以準(zhǔn)確推測(cè)骨骼肌挫傷時(shí)間。

3.2 骨骼肌挫傷后MMP-1的表達(dá)

MMP-1屬于由Zn2+依賴性內(nèi)肽酶組成的酶家族，正常人體內(nèi)分泌水平很低，參與創(chuàng)傷愈合過(guò)程時(shí)表達(dá)明顯增加。MMP-1可增加肌纖維的數(shù)目并通過(guò)促進(jìn)成肌細(xì)胞的遷移和分化來(lái)增加成肌細(xì)胞的覆蓋面積，從而促進(jìn)損傷骨骼肌的功能恢復(fù)[5]。李剛蓮[6]認(rèn)為MMP-2和MMP-9在皮膚切創(chuàng)后的表達(dá)具有規(guī)律性且有良好的時(shí)間相關(guān)性，均在傷后3 d達(dá)到高峰，12 d后恢復(fù)正常。李紅衛(wèi)等[7]建立大鼠右后肢槍彈創(chuàng)模型，發(fā)現(xiàn)大鼠創(chuàng)緣皮膚MMP-1和MMP-3 mRNA表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)呈明顯的增加趨勢(shì)，各時(shí)間點(diǎn)間有顯著性差異，在傷后3 d達(dá)到峰值，而陰性對(duì)照組MMP-1和MMP-3 mRNA幾乎沒(méi)有表達(dá)，認(rèn)為MMP-1和MMP-3在槍彈傷后的表達(dá)與損傷經(jīng)過(guò)時(shí)間有良好的相關(guān)性。盡管在前述類型損傷后MMPs家族中多個(gè)蛋白的表達(dá)具備時(shí)間相關(guān)性，但MMP-1在骨骼肌挫傷后是否具備時(shí)序性變化規(guī)律目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究顯示在對(duì)照組大鼠骨骼肌細(xì)胞內(nèi)MMP-1無(wú)表達(dá)；在實(shí)驗(yàn)組中，骨骼肌挫傷0.5 h后可檢測(cè)到MMP-1，且3 d后MMP-1的表達(dá)量達(dá)峰值，此后逐漸減少，至14 d時(shí)仍存在陽(yáng)性表達(dá)，總體呈上升-峰值-下降的變化規(guī)律，表明MMP-1的表達(dá)具有一定時(shí)序性變化規(guī)律。但與bFGF類似，MMP-1亦存在單值對(duì)應(yīng)多時(shí)間點(diǎn)的局限性，MMP-1陽(yáng)性細(xì)胞率和骨骼肌挫傷后時(shí)間亦無(wú)顯著相關(guān)，因此也難以單獨(dú)將其用于推測(cè)骨骼肌挫傷時(shí)間。

3.3 bFGF與MMP-1表達(dá)比值與骨骼肌挫傷時(shí)間的推斷

本研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌挫傷后bFGF與MMP-1陽(yáng)性細(xì)胞率的變化隨損傷時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)先升高-達(dá)峰值-后降低的變化趨勢(shì)。雖然二者的陽(yáng)性細(xì)胞率均隨損傷時(shí)間的變化具一定規(guī)律性，但某個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞率值往往可對(duì)應(yīng)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)。因此僅根據(jù)上述變化規(guī)律較難準(zhǔn)確推測(cè)骨骼肌挫傷的時(shí)間范圍。但本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)bFGF與MMP-1陽(yáng)性細(xì)胞率的比值為0時(shí)，bFGF未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)而MMP-1的陽(yáng)性細(xì)胞率高于正常水平，此時(shí)可推測(cè)骨骼肌挫傷的時(shí)間在3 h內(nèi)；當(dāng)二者的比值大于0且小于1.01，可推測(cè)骨骼肌挫傷時(shí)間為3 h～3 d；當(dāng)二者比值大于1.01即骨骼肌挫傷3 d后，bFGF與MMP-1的陽(yáng)性細(xì)胞率均高于正常水平，此時(shí)難以給出骨骼肌挫傷的時(shí)間區(qū)間。且本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)bFGF與MMP-1的陽(yáng)性細(xì)胞率比值與骨骼肌挫傷時(shí)間具有顯著相關(guān)性，因此前述規(guī)律用于推測(cè)骨骼肌挫傷時(shí)間具有一定法醫(yī)學(xué)價(jià)值。

綜上所述，研究比較先后不同時(shí)間表達(dá)的兩種生化指標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞率的比值，同時(shí)結(jié)合二者各自陽(yáng)性細(xì)胞率的變化情況，可在一定程度上用于推斷骨骼肌挫傷的時(shí)間范圍。