亞麻籽油和低氧處理對(duì)大鼠采食量、 葡萄糖和肝臟脂肪利用的影響

趙貴琴，劉雨詩，謝薇薇，白雪蓮，陳雪君

(杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018)

組織低氧是一種常見的生理和病理狀態(tài)，在人體多種器官發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用[1]。低氧使體內(nèi)原有生物氧化失衡，一定范圍內(nèi)，機(jī)體可通過加強(qiáng)糖酵解、促進(jìn)血管再生和紅細(xì)胞生成等途徑降低低氧對(duì)細(xì)胞造成的氧化損傷[2]。大量研究發(fā)現(xiàn)，低氧應(yīng)激時(shí)，葡萄糖是動(dòng)物組織和細(xì)胞供能的優(yōu)先底物，糖酵解相關(guān)的酶可被低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)激活，脂肪分解受阻[3]。人類呼吸暫停綜合癥可誘發(fā)非酒精性脂肪肝，說明慢性間隙性低氧抑制機(jī)體脂肪利用[4]。但另一些研究則認(rèn)為，低氧通過調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)等通路，促進(jìn)游離脂肪酸分解提供能量[5]。低氧還可以通過內(nèi)分泌等調(diào)節(jié)途徑降低肝臟糖酵解供能比例，增加脂肪酸的氧化利用[6]。適當(dāng)?shù)脱醮碳つ艽龠M(jìn)能量代謝和脂肪分解，改善低氧能量不足[7]。因此，低氧應(yīng)激時(shí)的能量代謝調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的過程，葡萄糖和脂類物質(zhì)作為供能的底物參與其中，但其作用機(jī)制仍不清楚。

亞麻酸(alpha-linolenic acid，ALA)是人體一種必需脂肪酸，屬于n-3系列多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)，亞麻籽油是ALA 主要天然來源。研究認(rèn)為，ALA及二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid， EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)等n-3 PUFA是脂肪酸代謝中重要的調(diào)節(jié)因子，能夠抑制脂肪合成，促進(jìn)脂肪分解，具有降低血脂等作用[8]。n-3 PUFA還能上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，增加機(jī)體對(duì)葡萄糖的攝入和利用，參與機(jī)體能量代謝調(diào)節(jié)過程[9]。目前很少有ALA與組織低氧之間的相互作用關(guān)系的研究報(bào)道。本研究從ALA作為營養(yǎng)調(diào)節(jié)因子的角度探討大鼠低氧應(yīng)激時(shí)對(duì)葡萄糖和脂肪的利用，研究兩者之間可能存在的互作關(guān)系，為促進(jìn)低氧狀態(tài)下的機(jī)體健康提供可能的營養(yǎng)調(diào)節(jié)途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

60只30日齡的清潔級(jí)雄性SD大鼠購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，初始體重為(69.50±0.36)g，于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行為期1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，溫度(22±1)℃，相對(duì)濕度50%～60%，日光燈調(diào)節(jié)光照時(shí)間為7： 00—19： 00。

1.2 動(dòng)物飼料

基礎(chǔ)飼料根據(jù)《GB 14924.3—2010 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 配合飼料營養(yǎng)成分》配制，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心生產(chǎn)提供。飼料含18%粗蛋白，4%粗脂肪，能量14 421 kJ·kg-1。試驗(yàn)組動(dòng)物飼料營養(yǎng)水平與基礎(chǔ)日糧相同，僅脂肪來源不同，試驗(yàn)組用亞麻籽油(2%)替代基礎(chǔ)日糧中的大豆油(2%)。適應(yīng)期全部動(dòng)物飼喂基礎(chǔ)飼料。

1.3 處理設(shè)計(jì)

將60只大鼠隨機(jī)分成4組，分別為對(duì)照常氧(CN)組、對(duì)照低氧(CH)組、試驗(yàn)常氧(FN)組和試驗(yàn)低氧(FH)組。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組飼喂添加亞麻籽油日糧。常氧組在實(shí)驗(yàn)室常壓下飼養(yǎng)，氣壓為101.23 kPa，氧氣含量為20.9%。低氧組低氧艙內(nèi)處理(每天22.5 h)，模擬海拔高度3 km，氣壓67.2 kPa，氧分壓15.1%。試驗(yàn)期間每天測(cè)體重，記錄大鼠攝食量并更換墊料，計(jì)算采食量和日增重。4周后，全部動(dòng)物處死，取全血自然凝血后，4 000 r·min-1離心15 min，分離血清，同時(shí)取動(dòng)物肝臟和腿部肌肉，所有樣品置于-80 ℃冰箱備用。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 血清和肝臟生化指標(biāo)

測(cè)定血清中能量代謝相關(guān)指標(biāo)，包括葡萄糖、丙酮酸、乳酸、總蛋白、白蛋白、尿素氮、總甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、游離脂肪酸、脂肪酸合成酶(FAS)、激素敏感脂酶(HSL)和脂蛋白脂酶(LPL)。以上測(cè)定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，在SpectraMax M5型酶標(biāo)儀上測(cè)定。

1.4.2 肝臟和肌肉相關(guān)基因mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

肝臟和肌肉組織總RNA提取利用Trzol試劑盒(美國Invitrogen公司)，按說明書操作。Oligo-dT隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用M-MLV cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)。qRT-PCR采用實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(日本TaKaRa公司)，在iQTM5多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)上進(jìn)行。PPARγ和GLUT-4基因引物根據(jù)Primer 5.0設(shè)計(jì)，由上海生物工程技術(shù)公司合成，引物序列見表1。以β-actin為參考基因，相對(duì)表達(dá)量用2-(ΔCt目的基因-ΔCt參考基因)表示。

表1 相關(guān)基因的引物序列

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用Statistic 7.0軟件進(jìn)行雙因子方差分析， Turkey’s HSD進(jìn)行組間多重比較。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 采食量和體增重

各處理對(duì)大鼠日采食量和體增重的影響見表2。結(jié)果表明，低氧可顯著降低大鼠日采食量和體增重，但亞麻籽油對(duì)兩者無顯著影響。低氧和亞麻籽油對(duì)日采食量和體增重不存在交互作用。

表2 各處理對(duì)大鼠日采食量和體增重的影響

注：同列無相同字母表示差異顯著(P<0.05)。雙因素方差分析,低氧處理P采食量=0.13，P體增重=0.47;亞麻籽油處理P采食量<0.001，P體增重<0.001;低氧×亞麻籽油P采食量=0.64，P體增重=0.58。

2.2 血清糖代謝

表3結(jié)果表明，低氧和亞麻籽油對(duì)血清葡萄糖、丙酮酸和乳酸均沒有顯著影響，且兩者之間不存在交互作用。

表3 各處理對(duì)大鼠血清糖代謝的影響

注：雙因素方差分析,低氧處理P葡萄糖=0.26，P丙酮酸=0.10,P乳酸=0.56;亞麻籽油處理P葡萄糖=0.14，P丙酮酸=0.07,P乳酸=0.41;低氧×亞麻籽油P葡萄糖=0.19，P丙酮酸=0.83,P乳酸=0.39。

2.3 血清蛋白質(zhì)代謝

表4結(jié)果表明，低氧對(duì)總蛋白和白蛋白含量無顯著影響，使尿素氮含量顯著升高；亞麻籽油對(duì)蛋白質(zhì)各項(xiàng)代謝指標(biāo)無影響，但兩者對(duì)尿素氮具有交互作用。

表4 各處理對(duì)血清蛋白質(zhì)代謝的影響

注：雙因素方差分析,低氧處理P總蛋白=0.75，P尿素氮=0.17,P白蛋白=0.08;亞麻籽油處理P總蛋白=0.45，P尿素氮<0.001,P白蛋白=0.44;低氧×亞麻籽油P葡萄糖=0.10，P尿素氮<0.01,P白蛋白=0.06。

2.4 血清脂質(zhì)代謝

亞麻籽油和低氧對(duì)大鼠血清脂質(zhì)代謝的影響見表5。結(jié)果表明，低氧和亞麻籽油對(duì)血清甘油三酯(TG)和游離脂肪酸(FFA)均沒有顯著影響；兩者均升高高密度脂蛋白(HDL)，降低低密度脂蛋白(LDL)，且低氧和亞麻籽油對(duì)兩者具有交互作用。

表5 各處理對(duì)血清脂質(zhì)代謝的影響 mmol·L-1

注：雙因素方差分析,低氧處理P甘油三酯=0.75，P高密度脂蛋白<0.01,P低密度脂蛋白<0.01,P游離脂肪酸=0.55;亞麻籽油處理P甘油三酯=0.12，P高密度脂蛋白<0.01,P低密度脂蛋白<0.05,P游離脂肪酸=0.12;低氧×亞麻籽油P甘油三酯=0.16，P高密度脂蛋白<0.05,P低密度脂蛋白<0.01,P游離脂肪酸=0.53。

2.5 肝臟脂肪代謝相關(guān)酶活性

亞麻籽油和低氧對(duì)大鼠肝臟脂肪代謝相關(guān)酶活性的影響見表6。結(jié)果表明，低氧對(duì)大鼠肝臟脂肪合成酶(FAS)和激素敏感脂酶(HSL)無顯著影響，使脂蛋白脂酶(LPL)活性顯著升高(P<0.01)。亞麻籽油對(duì)大鼠肝臟FAS活性無顯著影響，但顯著升高HSL和LPL活性，且亞麻籽油和低氧對(duì)LPL活性存在交互作用。

表6 各處理對(duì)大鼠肝臟脂肪代謝相關(guān)酶活性的

注：雙因素方差分析,低氧處理P脂肪合成酶=0.69，P激素敏感脂酶<0.01,P脂蛋白脂酶<0.01;亞麻籽油處理P脂肪合成酶=0.88，P激素敏感脂酶=0.11,P脂蛋白脂酶<0.01;低氧×亞麻籽油P脂肪合成酶=0.87，P激素敏感脂酶=0.25,P脂蛋白脂酶<0.01。

2.6 肝臟和肌肉有關(guān)基因mRNA

低氧和亞麻籽油都顯著增加了肝臟PPARγ和骨骼肌GLUT-4 mRNA的表達(dá)，且兩者對(duì)肝臟PPARγmRNA表達(dá)有交互作用(表7)。

表7 各處理對(duì)大鼠肝臟PPARγ、

注：雙因素方差分析,低氧處理P肝臟PPARγ<0.05，P肌肉GLUT-4<0.05;亞麻籽油處理P肝臟PPARγ<0.05，P肌肉GLUT-4<0.01;低氧×亞麻籽油P肝臟PPARγ<0.05，P肌肉GLUT-4=0.25。

3 討論

3.1 亞麻籽油和低氧對(duì)大鼠采食量與體增重的影響

正常情況下，動(dòng)物的采食量由下丘腦攝食中樞調(diào)控。在低氧應(yīng)急狀態(tài)下，內(nèi)分泌激素如腎上腺素、甲狀腺激素等分泌水平發(fā)生改變，一方面降低攝食量，另一方面增加能量消耗，導(dǎo)致體重減輕[10]。動(dòng)物持續(xù)的低氧刺激或人類由平原進(jìn)入高原地區(qū)，會(huì)引起食欲下降，體重減輕[11]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模擬3 000 m高原低氧處理4周，大鼠平均體增重顯著下降，采食量顯著降低，尿素氮顯著增加。已有研究表明，低氧刺激引起脂肪分解增加，導(dǎo)致大鼠白色脂肪細(xì)胞體積變小，總脂肪含量降低體重下降[12]。Hashimoto等[13]研究發(fā)現(xiàn)，低氧條件(5%氧氣)培養(yǎng)3T3-L1脂肪細(xì)胞1周后，脂肪細(xì)胞變小，甘油三酯含量降低50%。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧引起肝臟PPARγmRNA表達(dá)增加，LPL活性增加，促進(jìn)了脂肪的分解。因此，低氧刺激作用下大鼠攝食量減少，組織蛋白質(zhì)、脂肪分解增加，導(dǎo)致動(dòng)物平均體增重低于常氧組。本試驗(yàn)條件下，亞麻籽油對(duì)體增重和采食量沒有影響，和低氧也不存在交互作用，但有促進(jìn)肝臟PPARγmRNA表達(dá)增加，且與低氧具有交互作用，進(jìn)一步促進(jìn)脂肪分解。

3.2 低氧和亞麻籽油對(duì)大鼠葡萄糖利用的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，模擬3 000 m高原低氧處理4周和亞麻籽油日糧均顯著增加了骨骼肌GLUT-4 mRNA表達(dá)，但對(duì)血清糖代謝各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組相比無顯著差異。低氧狀態(tài)下，大鼠血糖水平、肝臟和骨骼肌對(duì)葡萄糖的攝取和利用不同的研究有不同的結(jié)果，可能與低氧處理時(shí)間、低氧程度、血糖檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)等不同相關(guān)。機(jī)體在低氧條件下，氧氣供應(yīng)不足，氧化還原酶系統(tǒng)活性降低，三羧酸循環(huán)受阻，糖酵解增強(qiáng)，脂肪被動(dòng)員用于肌肉的氧化供能同時(shí)血脂濃度降低[14]。 趙成玉等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在低氧條件下肝臟和胰腺GLUT-4 mRNA 表達(dá)明顯增加，肝臟和肌肉對(duì)葡萄糖的攝取和利用增加，同時(shí)糖異生減少，使血糖降低。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧增加了骨骼肌GLUT-4 mRNA表達(dá)，有增加葡萄糖利用的作用，但這種促進(jìn)作用比較有限，并沒有引起血糖的降低。Carreras等[16]研究發(fā)現(xiàn)，間歇低氧可以影響 GLUT-4 蛋白由胞質(zhì)到胞膜的易位過程，使胞膜GLUT-4 蛋白含量下降，從而影響骨骼肌攝取葡萄糖，導(dǎo)致胰島素抵抗，使葡萄糖的攝取和利用減少，血糖升高[17]。對(duì)運(yùn)動(dòng)員在模擬3 000 m高原環(huán)境訓(xùn)練的研究卻得到相反的結(jié)果，低氧顯著提高血漿胰島素與胰高血糖素的比例，導(dǎo)致血糖利用增加，而脂類的分解降低、合成增加，血漿游離脂肪酸降低[18]。

3.3 低氧與亞麻籽油對(duì)脂肪利用的影響

研究發(fā)現(xiàn)，模擬3 000 m高原低氧處理4周對(duì)大鼠血漿TG和FFA水平?jīng)]有顯著影響，HDL升高而LDL下降，肝臟LPL活性提高。LPL主要作用是將血漿脂蛋白(主要是乳靡微粒和極低密度脂蛋白)中的甘油三酯降解形成脂肪酸，用于氧化分解，降低LDL，升高HDL[19]。在低氧應(yīng)激過程中，一些激素或細(xì)胞因子起著重要作用，PPAR-γ是具有廣泛生理功能的脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，參與多條脂肪代謝通路。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧促進(jìn)肝臟PPAR-γmRNA表達(dá)的提高，進(jìn)而影響LPL等下游一系列脂肪代謝相關(guān)酶基因。路瑛麗等[7]研究發(fā)現(xiàn)，嚙齒類動(dòng)物低氧訓(xùn)練使骨骼肌中PPARs和肉堿酯酰轉(zhuǎn)移酶(CPT1)mRNA的表達(dá)升高，增加骨骼肌線粒體中脂肪酸的β-氧化。但是低氧處理對(duì)脂質(zhì)代謝的影響也有不同的結(jié)果。對(duì)人類呼吸暫停綜合癥的研究發(fā)現(xiàn)，慢性間歇性低氧導(dǎo)致胰島素抵抗，使血液游離脂肪酸和葡萄糖水平升高，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致非酒精性脂肪肝[4]。低氧通過降低CPT1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，抑制長鏈脂肪酸向線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)，減少脂肪β-氧化，導(dǎo)致脂肪在肝細(xì)胞沉積，但脂肪合成沒有影響[6]。

亞麻籽油促進(jìn)了大鼠肝臟PPAR-γmRNA表達(dá)的提高，進(jìn)一步使肝臟LPL和HSL活性升高，升高了HDL，降低了LDL，其中對(duì)LPL活性的影響與低氧具有交互作用，但對(duì)TG和FFA沒有顯著影響。研究發(fā)現(xiàn)，富含DHA的魚油對(duì)脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)是通過PPARs途徑，升高動(dòng)物肝臟和血漿的LPL，從而升高HDL[20-21]。ALA屬于n-3系列PUFA，在動(dòng)物和人體內(nèi)可以通過碳鏈延長和去飽和作用合成EPA和DHA，但目前對(duì)亞麻籽油調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的研究遠(yuǎn)不如魚油多。Fukumitsu 等[22]通過3T3L-1細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn)，ALA通過SREBP途徑抑制FAS活性，減少膽固醇和甘油三酯合成，同時(shí)使CPT1 and瘦蛋白水平升高，促進(jìn)脂肪分解利用，細(xì)胞內(nèi)ATP增加。Barrena 等[23]認(rèn)為，ALA具有抑制動(dòng)物高脂飲食引起的糖類和脂類代謝紊亂作用。

綜上所述，本試驗(yàn)低氧艙模擬3 000 m高原環(huán)境低氧處理大鼠4周，降低大鼠采食量，增加蛋白質(zhì)和脂肪分解，增加能量消耗、降低體增重。添加亞麻籽油對(duì)采食量和蛋白質(zhì)代謝沒有影響，但通過增加PPAR-γmRNA表達(dá)，提高LPL和HSL活性增加脂肪利用，改善低氧能量供應(yīng)。