不同管理模式下設(shè)施番茄土壤微生物變化

任春暉，王遠(yuǎn)宏，常若葵，劉慧芹，張斌，池明，于瑋瑋

(天津農(nóng)學(xué)院 園藝系，天津 300384)

土壤是覆蓋在地球表面的一層可以生長植物的疏松物質(zhì)，由各種有機(jī)物、無機(jī)物、微生物等共同組成。土壤是微生物、農(nóng)作物、動物乃至人類賴以生存的基礎(chǔ)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以及人口數(shù)量的日益增加，對有限的土壤資源進(jìn)行長遠(yuǎn)高效的利用成了當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。微生物群體幾乎存在于世界的每一個生態(tài)群落之中，從動物到人類，從土壤到植被，從樹木到森林，都扮演者不可或缺的角色，但是土壤中數(shù)以萬億計的微生物種類中，僅0.1%～1%的物種可培養(yǎng)，極大地限制了人們對于微生物群體結(jié)構(gòu)及功能多樣性的研究。

DNA測序技術(shù)從以Sanger法為代表的第一代測序技術(shù)發(fā)展到如今的高通量測序(HTS)技術(shù)，經(jīng)歷了久遠(yuǎn)而艱難的過程。高通量測序技術(shù)以成本低廉[1]、產(chǎn)出量高的特點(diǎn)，成為現(xiàn)代測序領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的方法?？蒲腥藛T利用高通量測序技術(shù)在病毒分子的進(jìn)化、基因組變異、微生物多樣性研究與臨床診斷等眾多方面進(jìn)行了深層次的研究。目前，高通量測序中最為成熟的組學(xué)就是宏基因組學(xué)。宏基因組學(xué)[2]誕生于20世紀(jì)，規(guī)避了分離培養(yǎng)，可將環(huán)境中所有的DNA提取出來，在宏觀上對基因組進(jìn)行整體研究，為人類了解自然界中不能被培養(yǎng)的微生物提供了客觀全面認(rèn)知的途徑。宏基因組技術(shù)目前主要應(yīng)用在兩個方面：篩選所需功能基因和研究微生物與環(huán)境的互作。本試驗以施用枯草芽孢桿菌、地特靈和常規(guī)施肥3種管理模式下的番茄土壤微生物為研究對象，利用宏基因組學(xué)研究樣本中的微生物組成和互作情況，同時在分子水平對其代謝通路、基因功能進(jìn)行研究[3]，以期為優(yōu)化、明確大棚內(nèi)設(shè)施番茄施肥量及施肥種類提供一定的試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 處理設(shè)計

試驗于2017年3—6月在天津市武清區(qū)番茄種植大棚內(nèi)進(jìn)行。供試番茄品種為以色列選育的海澤拉?？莶菅挎邨U菌來自保定市科綠豐生化科技有限公司，地特靈系山東農(nóng)夫生物科技有限公司所產(chǎn)。

試驗共設(shè)3個處理：對照(CK)，土壤加有機(jī)肥(667 m210 m3)后直接旋耕作畦；處理1，土壤加有機(jī)肥(667 m210 m3)后，用枯草芽孢桿菌對水(667 m2100 g)噴霧土壤表面；處理2，土壤加有機(jī)肥(667 m210 m3)后，用地特靈拌細(xì)砂(667 m21 kg)均勻撒施在土壤表面，后旋耕作畦。每小區(qū)面積9.8 m2，每個處理重復(fù)3次。

1.2 測序數(shù)據(jù)預(yù)處理與分析

1.2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控

從9個小區(qū)內(nèi)番茄根際土壤取樣，將樣本低溫運(yùn)輸(0 ℃以下)送往諾合致源公司。由該公司對試驗樣本進(jìn)行DNA提取、文庫構(gòu)建，以及測序等操作[4]。

1.2.2 Metagonomic組裝

經(jīng)過預(yù)處理得到“clean data”，使用SOAP組裝軟件進(jìn)行組裝分析，將個體組裝與混合組裝所得到的“scaffolds”從N連接處打斷，得到的序列片段稱為“scaftigs”[5]。將500 bp以下的片段剔除，得到用于后續(xù)分析的基因片段(unigenes)[6]。

1.2.3 基因預(yù)測

將scaftigs進(jìn)行基因預(yù)測去冗余后獲得初始“gene catalogue”[7]，然后將9個樣品的clean data與gene catalogue比對，得出各基因片段在各樣品中的數(shù)目，從數(shù)目及基因長度出發(fā)，計算出各基因在不同樣本中的豐度信息[8]。

1.3 物種注釋

首先，使用Diamond軟件將unigenes與從美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的NR數(shù)據(jù)庫中抽提出的細(xì)菌、真菌、古菌和病毒序列進(jìn)行比對[9]；然后，從注釋結(jié)果及基因豐度出發(fā)，獲得各個樣品在門分類層級上的豐度信息[10]。某個物種在某個樣品中的豐度，等于注釋為該物種的基因豐度的加和。

1.4 常用功能數(shù)據(jù)庫注釋

使用Diamond軟件將各樣本的unigenes與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。對于每一條序列的比對結(jié)果，選取得分(score)最高的比對結(jié)果進(jìn)行后續(xù)分析[11]。從比對結(jié)果出發(fā)，得出各樣本在第一層級上的6大類功能基因相對豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)預(yù)處理與分析

2.1.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控

經(jīng)分析，3個處理的測序有效性分別為99.61%、98.89%、99.37%。結(jié)果均已達(dá)標(biāo)，可以用作后續(xù)分析[12]。

2.1.2 組裝結(jié)果

CK樣本組裝得到的scaftigs的總長度為175 344 050 bp，條數(shù)是218 091條，平均每條scaftigs的長度為803 bp。將scaftigs按照長度進(jìn)行排序，由長到短加和，當(dāng)加和值達(dá)到scaftigs總長的50%時，對應(yīng)的scaftig的長度為759 bp，加和值達(dá)到總長的90%時，對應(yīng)的scaftig的長度為531 bp。在CK樣本中，組裝得到的最長scaftig的長度為97 391 bp。

處理1樣本組裝得到的scaftigs的總長度為162 840 829 bp，條數(shù)是193 945條，平均每條scaftigs的長度為840 bp。將scaftigs按照長度進(jìn)行排序，由長到短加和，當(dāng)加和值達(dá)到scaftigs總長的50%時，對應(yīng)的scaftig的長度為811 bp，加和值達(dá)到總長的90%時，對應(yīng)的scaftig的長度為535 bp。在處理1樣本中，組裝得到的最長scaftig的長度為56 220 bp。

處理2樣本組裝得到的scaftigs的總長度為167 676 448 bp，條數(shù)是201 937條，平均每條scaftigs的長度為822 bp。將scaftigs按照長度進(jìn)行排序，由長到短加和，當(dāng)加和值達(dá)到scaftigs總長的50%時，對應(yīng)的scaftig的長度為765 bp，加和值達(dá)到總長的90%時，對應(yīng)的scaftig的長度為531 bp。在處理2樣本中，組裝得到的最長scaftig的長度為110 747 bp。

2.1.3 基因預(yù)測

經(jīng)分析，gene catalogue中基因數(shù)為2 019 168，其中：只含有起始密碼子的基因數(shù)為411 103(占比20.36%)，只含有終止密碼子的基因數(shù)為504 186(占比24.97%)，沒有起始密碼子也沒有終止密碼子的基因數(shù)為521 349(占比25.82%)；完整基因(既有起始密碼子也有終止密碼子)數(shù)為582 530(占比28.85%)。gene catalogue中基因的總長為917.19 Mbp，平均長度為226.54 bp，基因的整體GC含量為61.3%。

2.2 不同管理模式下土壤微生物的群落變化

如表1所示，3個處理中土壤微生物總相對豐度排在前10位的細(xì)菌包括變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、毛霉菌門(Mucoromycota)、浮霉菌門(Planctomycetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)。不同處理的優(yōu)勢菌分布及相對豐度存在一定差異。處理1和處理2中相對豐度排在前10位的優(yōu)勢種群相對豐度高于CK，且芽單胞菌和放線菌所占比例均高于CK，說明施用枯草芽孢桿菌或者迪特靈可以在一定程度上提高這兩種菌的豐度。

表1 各處理的優(yōu)勢菌群占比 %

2.3 組間差異物種的LEfSe分析

為了進(jìn)一步探究施用枯草芽孢桿菌和迪特靈后土壤微生物群落的變化，采用LEfSe分析對3個處理的菌群相對豐度進(jìn)行比較[13]，以找出顯著性變化的菌群。對照組與處理1相比，具有顯著性差異的種群共15種，由高到低依次為芽單胞菌綱、Gemmatirosa屬、未分類的芽單胞菌目、未分類的芽單胞菌科、未分類的芽單胞菌綱、未分類的綠彎菌綱、未分類的綠彎菌目、Gemmatirosa_kalamazoonesis種、芽單胞菌桿菌屬SCN_70_22種、芽單胞菌sp_SG8_23種、β變形菌桿菌屬_RIFCSPLOWO2_12_FULL_68_19種、芽單胞菌屬、未分類的綠彎菌屬、芽單胞菌_sp_SM23_52屬、類諾卡氏屬。對照組與處理2相比，具有顯著性差異的種共8種，分別為芽單胞菌種、β變形菌_桿菌屬_RUFCPLOWO2_12_FULL_65_14、變形菌RUFCPLOWO2_12_FULL_68_19種、變形菌SCGC_AG_212_123種、未分類的綠彎菌科、未分類的綠彎菌目、未分類的綠彎菌綱、綠彎菌_OLB7種。

2.4 不同管理模式下KEGG代謝通路分析

將unigenes與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得出在第一層級上的各處理相對豐度分析結(jié)果[14]。由表2可知， CK中第一層級上的代謝相關(guān)基因最多，占13.13%，遺傳信息處理相關(guān)基因占4.45%，環(huán)境信息處理相關(guān)基因占3.81%，細(xì)胞過程相關(guān)基因占2.22%，人類疾病相關(guān)基因占1.79%，生物體系統(tǒng)相關(guān)基因占比最少，為0.94%。在處理1中，同樣以代謝基因占比最大，為16.26%，其次為環(huán)境信息處理基因，占5.99%，再次為人類疾病相關(guān)基因，占5.52%，之后依次為遺傳信息處理基因(4.48%)、細(xì)胞過程相關(guān)基因(4.17%)、生物體系統(tǒng)相關(guān)基因(3.69%)。在處理2中，各類基因占比由高到低依次為代謝相關(guān)基因(15.63%)、環(huán)境信息處理基因(4.57%)、遺傳信息處理相關(guān)基因(4.48%)、細(xì)胞過程相關(guān)基因(2.80%)、人類疾病相關(guān)基因(2.71%)、生物體系統(tǒng)相關(guān)基因(1.57%)。

表2 各處理代謝通路相關(guān)基因占比 %

KEGG模塊是一個由人工定義的功能單元集合，由M號識別，用于對序列基因組進(jìn)行注釋和生物學(xué)解釋。下面選取了10種在KEGG代謝路徑圖中的致密功能單元(M00360、M00359、M00009、M00173、M00178、M00011、M00144、M00237、M00179、M00374)，以期發(fā)現(xiàn)各處理間的功能相似性。如表3所示，M00360、M00359、M00009、M00173模塊在番茄3組處理中的變化情況相同，都是在CK中最多，處理2次之，處理1最低。M00178模塊在處理2中含量最高，其次為處理1，在CK中最低。M00011模塊以CK中含量最高，其次為處理2，含量最低的為處理1。M00144模塊以處理2含量最高，CK次之，以處理1最低。M00237模塊以CK含量最高，其次為處理2，最低的為處理1。M00179模塊以處理2中含量最高，其次為處理1，含量最低的為CK。M00374模塊在CK中含量最高，其次為處理2，含量最低的為處理1。

表3 各處理KEGG模塊分布

3 小結(jié)

組裝結(jié)果顯示，3個處理中組裝得到的最長片段出現(xiàn)在施用地特靈的處理中。從平均長度來看，施用枯草芽孢桿菌處理的高于對照組和施用地特靈的處理。表明施加生物肥料，可以在一定程度上保持土壤細(xì)菌基因片段的完整性。從各處理結(jié)果來看，CK測序有效性最高，施用地特靈處理的次之，最低的為施用枯草芽孢桿菌的處理，說明番茄傳統(tǒng)耕作模式下根基土壤微生物宏基因組中群落穩(wěn)定性更高。基因數(shù)目差異分析顯示，以施用枯草芽孢桿菌處理的差異最大，而施用地特靈處理的最小，說明在番茄土壤中施加枯草芽孢桿菌可以在一定程度上增加群落多樣性。土壤微生物群落組成影響土壤養(yǎng)分循環(huán)，對于維持農(nóng)田生產(chǎn)力與保護(hù)環(huán)境有重要意義?？莶菅挎邨U菌菌體生長過程中產(chǎn)生的枯草菌素、多黏菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，對致病菌或內(nèi)源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要作用。本研究條件下，施加枯草芽孢桿菌與地特靈可以有效增加番茄土壤中變形菌、放線菌和藍(lán)細(xì)菌等有益微生物的含量，由LEfSe分析結(jié)果可知，施用枯草芽孢桿菌或地特靈后，芽單胞菌、綠彎菌、變形菌等有益微生物類群顯著提高，有助于提高土壤微生物活性，改善微生物結(jié)構(gòu)和功能，從而實(shí)現(xiàn)土壤微生物生態(tài)平衡。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，在番茄土壤中施用地特靈或枯草芽孢桿菌可以大幅提高代謝類基因所占比例，同時人類疾病相關(guān)基因、環(huán)境信息處理、生物體系統(tǒng)、細(xì)胞過程，以及遺傳信息處理的基因占比均有所提高，表明番茄土壤中施用地特靈或枯草芽孢桿菌可以增強(qiáng)微生物代謝活性，從而提高土壤微生物功能多樣性。本研究顯示，施加生物肥料有利于維持微生物群落多樣性和功能多樣性，改善土壤理化性質(zhì)，從而更好地維持土壤微生物生態(tài)平衡。