醋酸去氨加壓素雜質Ⅰ國家對照品研制

王綠音 張 慧* 李 懿 張 偉 梁成罡*

（中國食品藥品檢定研究院，北京100050）

醋酸去氨加壓素為天然精氨鹽加壓素的結構類似物，即1-半胱氨酸脫去氨基和以8-D-精氨酸取代8-L-精氨酸[1]。化學名：巰基丙酰-L-酪氨酰-L-苯丙氨酰-L-谷氨酰氨酰-L-天冬酰氨酰-L-半胱氨酰-L-脯氨酰-D-精氨酰-L-甘氨酰胺醋酸鹽（1，6-二硫環(huán)）[2]。臨床上被廣泛用于治療兒童夜尿癥[3]、尿崩癥[4]、輕度血友病及血管性血友病[5]。醋酸去氨加壓素及注射液美國藥典[6]與中國藥典[7]均有收載。雜質Ⅰ為醋酸去氨加壓素主要降解產物，由肽鏈中的谷氨酰胺脫氨形成谷氨酸而得。中國藥典2015版二部醋酸去氨加壓素品種項下采用雜質Ⅰ與主成分的分離度來考察系統(tǒng)是否適用及對雜質Ⅰ進行定位，同時采用主成分自身對照法對雜質Ⅰ的含量進行了控制，限度控制在0.5%[7]。因此，醋酸去氨加壓素雜質Ⅰ國家對照品的研制對國家標準的順利實施、市場監(jiān)管和生產企業(yè)放行都有很重要的意義。

本研究對醋酸去氨加壓素雜質Ⅰ進行了結構確證、純度分析并采用質量平衡法確定含量，建立了首批醋酸去氨加壓素雜質Ⅰ對照品，本品適用于中國藥典醋酸去氨加壓素及制劑中的雜質定位和鑒別。

1 儀器與材料（試藥）

1.1 儀器：Metrohm 851水分測定儀，島津LC-10AD高效液相色譜儀，安捷倫1260高效液相色譜儀，9.4T Q-FT-ICR-MS（Bruker）質譜儀，Synapt HD ESI-MS/MS質譜儀。

1.2 材料：醋酸去氨加壓素雜質Ⅰ原料購于深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司（批號：150203），18種氨基酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號140624-200805），PITC（J&K），醋酸去氨加壓素對照品（中檢院，140717-200901）醋酸，醋酸鈉，鹽酸，三乙胺，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，二硫蘇糖醇為分析純，乙腈，甲醇為色譜純。

2 方法與結果

2.1 結構確證

2.1.1 分子量測定[8]：儀器為Apex II型傅立葉變換離子回旋共振質譜儀9.4T Q-FT-ICR-MS，正離子檢測模式，離子源ESI，源溫150 ℃進行分子量測定，圖1中m/z 1070.417為待標品實際檢測的分子離子峰[M+H]+，與理論分子量一致（理論分子量為1070）。

2.1.2 序列分析[8]：儀器為Synapt HD ESI-MS/MS檢測條件為：正離子檢測方式，毛細管電壓0.8～2 kV，cone電壓35 eV，collision電壓25～40 eV，MCP檢測器電壓2300 eV，離子源ESI，源溫80 ℃進行多肽序列分析，待標品溶液用二硫蘇糖醇（DTT）還原二硫鍵，還原后的樣品進行一級質譜分析（圖2）。對圖2 中雙電荷m/z為536.65的串聯(lián)質譜分析（TOF MSMS）圖譜見圖3，分析結果待標品部分氨基酸序列為YFENCPRG-NH2，同時測定醋酸去氨加壓素國家對照品的氨基酸序列為YFQNCPRG-NH2，比較上述兩個氨基酸序列可以推斷，雜質Ⅰ待標品的氨基酸組成中的谷氨酸替代了醋酸去氨加壓素中的谷氨酰胺，其他氨基酸一致。

圖1 醋酸去氨加壓素雜質Ⅰ分子量質譜圖

圖2 醋酸去氨加壓素雜質Ⅰ一級質譜

圖3 雙電荷m/z為536.65的串聯(lián)質譜分析圖譜

圖4 醋酸去氨加壓素雜質Ⅰ的RP-HPLC色譜圖

2.2 純度分析[7]：采用十八烷基鍵合硅膠色譜柱，以0.067 mol/L磷酸氫二鈉和0.067 mol/L磷酸二氫鉀（pH 7.0）為流動相A；乙腈為流動相B；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為220 nm。洗脫梯度的初始狀態(tài)為12%B相，保持4 min，在14 min內將B相增至21%，然后在17 min內將B相增至26%，再在5 min內將B相降為12%，保持10 min。稱取待標品適量，加水制成1 mg/mL的溶液，取50 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按峰面積歸一化法計算，結果為99.88%。圖4所示為系統(tǒng)適用性樣品色譜圖，可見雜質Ⅰ在醋酸去氨加壓素之前出峰，二者可有效分離。

2.3 氨基酸組成分析：采用十八烷基鍵合硅膠色譜柱，以0.1 mol/L醋酸鈉-乙腈（93∶7）為流動相A，乙腈-水（4∶1）為流動相B，流速為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm。洗脫梯度的初始狀態(tài)為100%A相，在8 min內將B相增至15%，然后在9 min內將B相增至34%，再在3 min內將B相增至100%，保持4 min，在回到初始狀態(tài)。分別稱取待標品及8中氨基酸對照品適量，進行水解，并進行柱前異硫氰酸苯酯（PITC）衍生，進行液相檢測。結果表明（表1），酪氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸等8個氨基酸比值的測定結果均符合中國藥典2015版二部醋酸去氨加壓素項下的規(guī)定。

表1 氨基酸比值結果

2.4 理化性質分析：①性狀：醋酸去氨加壓素雜質Ⅰ為白色粉末。在純水和1%醋酸中易溶，在乙醇溶液中可溶。②化學鑒別：取待標品適量，加水制成約1 mg/mL的溶液，加入雙縮脲試劑1 mL，溶液顯藍紫色。③水分：采用Metrohm 851水分測定儀對分裝后待標品樣品進行了卡氏庫侖法測定水分，結果為3.597%。④酸度：用純水制成約2.5 mg/mL溶液，溶液的pH值為4.6。⑤溶液顏色與澄清度：用純水制成約2.5 mg/mL溶液，為澄清無色溶液。⑥醋酸：采用中國藥典2015版四部通則0872合成多肽中醋酸測定法[9]進行HPLC法醋酸含量測定，結果為4.28%。

2.5 量值確定：根據水分和純度的測定結果，以質量平衡法計算，本批對照品的含量（%）=（100%-水分%-醋酸%）×HPLC純度%=92.012%，修約為92.0%。

3 結果與討論

近年來，世界范圍內對合成肽類藥物的研發(fā)正迎來一個新的高潮。從各國監(jiān)管方審評審批以及技術指南的角度，對合成肽類藥物研發(fā)中工藝相關和降解相關的有關物質質控要求達到了一個新的高度。在已上市合成肽類藥物的標準提高研究、藥典標準起草和修訂過程中，基于已知產品相關雜質的系統(tǒng)適用性要求、雜質及有關物質的定性定量要求，已成為關注要點。

中國藥典（Chp2015）及美國藥典（USP41-NF36）醋酸去氨加壓素品種項下均采用主成分作為對照的方法進行雜質的控制，USP41-NF36僅采用縮宮素與主成分的分離度作為考察系統(tǒng)適用性的指標，Chp2015則要求醋酸去氨加壓素雜質Ⅰ與主成分的分離度。研究發(fā)現(xiàn)，采用Chp2015的方法所得的色譜圖中，縮宮素峰與主成分峰的相對保留時間（RRT）為3.28，雜質Ⅰ與主成分峰的RRT為0.95。上述結果表明，醋酸去氨加壓素雜質Ⅰ本身為醋酸加壓素的降解產物，其與主峰的分離特性比縮宮素更能反映系統(tǒng)適用性。

采用質譜法對醋酸去氨加壓素雜質Ⅰ進行結構確證，因雜質Ⅰ結構中1位的巰基丙酰及本品全序列的特性，使得質譜無法測得其準確信息。故同時測定了醋酸去氨加壓素的氨基酸序列，通過比較二者測得序列的相似性，進一步佐證所測雜質Ⅰ氨基酸序列的正確。氨基酸組成的分析結果中，除半胱氨酸外其余各氨基酸比值均與理論值一致。這是因為半胱氨酸在水解時易降解，故所測比值偏低，但仍符合中國藥典2015版二部醋酸去氨加壓素項下的規(guī)定 。本研究通過化學反應、質譜分子量、二級質譜以及氨基酸測序，對醋酸去氨加壓素雜質Ⅰ進行了結構確證。按質量平衡法計算其含量，本批對照品的含量為92.0%，反相液相色譜法分析結果表明，本品與主成分醋酸去氨加壓素可以很好分離，分離度達到5.2，可用于醋酸去氨加壓素及制劑標準中醋酸去氨加壓素雜質Ⅰ的鑒別和定位，便于去氨加壓素雜質進行定性控制。