血漿miRNA—21和miRNA—142—5p表達水平對腎細胞癌的診斷價值評價

李乾 姜福金 溫儒民 王文天

[摘要] 目的 探討血漿miRNA-21和miRNA-142-5p表達水平在腎細胞癌臨床診斷中的價值。 方法 收集淮安市第二人民醫(yī)院2015年7月～2017年10月的腎細胞癌患者和良性腎病患者血液標(biāo)本，分別為55例和49例。應(yīng)用實時熒光定量PCR法檢測腎細胞癌患者和良性腎病患者血漿中miRNA-21和miRNA-142-5p的表達，并分析血漿miRNA-21和miRNA-142-5p表達量與腫瘤患者臨床病理特征的相關(guān)性。構(gòu)建受試者工作特征（ROC）曲線，評估這兩個血漿miRNAs對于腎細胞癌的診斷效能。 結(jié)果 腎細胞癌患者血漿中miRNA-21和miRNA-142-5p的表達水平均明顯高于良性腎疾病患者（P < 0.01）。血漿miRNA-21的表達水平與腎細胞癌的臨床分期顯著相關(guān)（P < 0.05），而血漿miRNA-142-5p的表達與腎細胞癌患者的臨床病理特征無明顯相關(guān)性（P > 0.05）。55例腎細胞癌患者血漿中miRNA-21、miRNA-142-5p表達量無明顯相關(guān)性（P > 0.05）。血漿miRNA-21和miRNA-142-5p的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.826（95%CI：0.794～0.912）和0.805（95%CI：0.744～0.919）。血漿miRNA-21診斷腎細胞癌的敏感性和特異性分別為81.8%和83.7%，血漿miRNA-142-5p診斷腎細胞癌的敏感性和特異性分別為80.0%和77.6%。而兩種miRNAs聯(lián)合檢測，診斷腎細胞癌的敏感性提高至87.3%，但特異性略有下降，為75.5%。 結(jié)論 血漿中miRNA-21和miRNA-142-5p表達水平很有可能成為腎細胞癌診斷的潛在生物標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞] 熒光定量PCR；腎細胞癌；miRNA-21；miRNA-142-5p；診斷

[中圖分類號] R737.11 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）07（c）-0004-05

Evaluation of diagnosis value of plasma miRNA-21 and miRNA-142-5p in renal cell carcinoma

LI Qian1 JIANG Fujin2 WEN Rumin1 WANG Wentian3

1.Clinical College， Xuzhou Medical University， Jiangsu Province， Xuzhou 221004， China； 2.Depatrment of Urinary Surgery， the Second People′s Hospital of Huai′an， Jiangsu Procince， Huai′an 212001， China； 3.The State Key Laboratory of Experimental Hematology， Institute of Hematology & Blood Disease Hospital， Chinese Academy of Medical Sciences， Tianjin 300020， China

[Abstract] Objective To investigate the clinical values of plasma miRNA-21 and miRNA-142-5p expression levels in the diagnosis of renal cell carcinoma （RCC）. Methods Blood samples of patients with RCC and bebign renal disease from July 2015 to October 2017 in the Second People′s Hospital of Huai′an were collected， there were 55 cases and 49 cases respectively. The expression levels of plasma miRNA-21 and miRNA-142-5p were determined by fluorescence quantitative PCR in these patients. The correlations between the two miRNAs levels in plasma and clinicopathological characteristics of patients with RCC were analyzed. The diagnostic performance of each miRNA to distinguish RCC from benign renal disease was evaluated by the receiver operating characteristic （ROC） curve analysis. Results The levels of plasma miRNA-21 and miRNA-142-5p in RCC patients were higher than those in benign renal disease （P < 0.01）. There was no significant correlation between plasma miRNA-142-5p levels and clinicopathological characteristics of RCC patients （P > 0.05）， whereas the expression levels of plasma miRNA-21 was correlated with clinical stages （P < 0.05）. There was no significant correlation between the expression of miRNA-21 and miRNA-142-5p in the plasma of 55 patients with RCC （P > 0.05）. The area under ROC curve of the two miRNAs were 0.826 （95%CI：0.794-0.912） and 0.805 （95%CI：0.744-0.919）. The sensitivity and specificity were 81.8% and 83.7% for miRNA-21， and 80.0% and 77.6% for miRNA-142-5p， respectively， for diagnosing RCC. And the sensitivity was increased to 87.3% with miRNA-21 in combination with miRNA-142-5p， despite slightly decreased specificity which was 75.5%. Conclusion These findings demonstrated that plasma miRNA-21 and miRNA-142-5p may serve as a promising biomarker in the diagnosis of RCC.

[Key words] Fluorescent quantitative RT-PCR； Renal cell carcinoma； miRNA-21； miRNA-142-5p； Diagnosis

腎細胞癌是腎臟最常見的惡性腫瘤。研究表明，腎細胞癌發(fā)病率每年進行性遞增[1]。腎細胞癌根治術(shù)仍是當(dāng)前主要手段，但對于腎細胞癌晚期療效不佳，30%～50%的腎細胞癌患者因缺乏早期臨床表現(xiàn)而錯過最佳手術(shù)時機。如何提高腎細胞癌的早期檢出率仍是惡性腫瘤研究的前沿，目前暫無有臨床價值的腫瘤標(biāo)志物。因此，尋找腎細胞癌的篩查及診斷的生物學(xué)標(biāo)志物至關(guān)重要。

研究發(fā)現(xiàn)miRNA可通過綁定靶mRNA的3′非編碼區(qū)，導(dǎo)致信使RNA降解或轉(zhuǎn)錄抑制[2]。它在腫瘤中存在突變[3]，進而調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有文獻報道m(xù)iRNA-21在腎細胞癌組織和外周血中表達均上調(diào)[4-5]，miRNA-142-5p在腎細胞癌組織中呈高表達[6]。關(guān)于血漿miRNA-21及miRNA-142-5p是否可聯(lián)合作為腎細胞癌診斷的生物標(biāo)志物值得研究。因此，本研究應(yīng)用熒光定量PCR法檢測腎細胞癌患者及良性腎疾病患者血漿miRNA-21和miRNA-142-5p的相對表達量，探討它們用于腎細胞癌診斷的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究已通過了江蘇省淮安市醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并與研究對象簽署了知情同意書。選取江蘇省淮安市第二人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）2015年7月～2017年10月的腎細胞癌患者55例，均為未接受過任何治療的初診患者，腎臟轉(zhuǎn)移瘤除外，所有入組RCC患者均已明確病理診斷。其中男41例，女14例；年齡35～81歲；有吸煙史40例，無吸煙史15例；組織學(xué)類型：透明細胞癌39例，乳頭狀癌7例，嫌色細胞癌6例，未分類癌3例；根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）2002年制訂的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期+Ⅱ期25例、Ⅲ期+Ⅳ期30例；病理學(xué)檢查報告僅31例有腫瘤分化程度分級表述，其中低分化13例，中高分化18例。另選擇同期入住我院的良性腎病患者49例作為對照組，包括腎結(jié)石21例，腎囊腫20例，腎炎5例，腎外傷2例，腎錯構(gòu)瘤1例（檢查均排除惡性腫瘤可能）；男30例，女19例；年齡22～65歲。并抽取20例健康志愿者的血漿標(biāo)本作為研究對象血漿miRNA時的校對值（其中男12例，女8例，年齡26～40歲）。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本的收集 所有研究對象均用抗凝管抽取外周靜脈血6 mL，2 h內(nèi)于實驗室低速離心機離心10 min，離心半徑100 mm，轉(zhuǎn)速2500 r/min，提取血漿600 μL，用1.5 mL無RNA酶的EP管分裝，凍存于-80℃超低溫冰箱。

1.2.2 總RNA的提取 總RNA的提取按照美國ABI公司的mirVana PARIS試劑盒的說明書操作，所有過程在超凈工作臺上完成，提取的RNA最終用DEPC水溶解，其濃度及純度使用U-2800紫外分光光度儀測定，置-20℃冰箱備用。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 使用日本Takara公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，采用莖-環(huán)法，采用25 μL反應(yīng)體系：9 μL的RNA模板加入RT引物工作液2 μL混勻后，在PCR儀加熱至70℃ 10 min，冰育2 min。再依次加入5×PrimeScript Buffer 5 μL、PrimeScript RT Enzyme MixI 1 μL以及DEPC水8 μL，瞬時離心，進行RT反應(yīng)：PCR儀42℃ 60 min，70℃ 10 min。

1.2.4 實時熒光定量PCR 選用日本Takara公司的實時熒光定量PCR試劑盒，按照廣州銳博公司的miRNA莖-環(huán)結(jié)構(gòu)引物的說明書進行操作：以U6作為內(nèi)參基因，每份血漿標(biāo)本均擴增U6、miRNA-21、miRNA-142-5p。采用20 μL反應(yīng)體系：包括cDNA 2 μL，SYBRGree Mix 9 μL，Bulge-loopTM miRNA Forward Primer（5 μm）0.8 μL，Bulge-loopTM miRNA Reverse Primer（5 μm）0.8 μL，Rox Reference DyeⅡ0.4 μL，RNase-free水7 μL，瞬時離心后，放入PCR儀內(nèi)，溫度設(shè)定為95℃ 20 s；95℃ 10 s，60℃ 20 s，共40個循環(huán)，每份標(biāo)本重復(fù)做3次。根據(jù)熒光定量PCR儀檢測所得的Ct值，采用2-△△Ct的方法計算血漿miRNA-21和miRNA-223的相對表達量，△△Ct實驗組△Ct-校正值△Ct=（實驗組目的基因Ct-U6Ct）-（對照組目的基因Ct-U6Ct）。實驗組包括腎細胞癌組和良性腎病組。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，故用中位數(shù)M，四分位數(shù)間距Q（P25，P75）表示，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗；相關(guān)性分析采用典型相關(guān)分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。并建立ROC曲線，根據(jù)AUC評估血漿miRNA-21和miRNA-142-5p用于診斷腎細胞癌的效能，根據(jù)約登指數(shù)最大時所對應(yīng)的點，在ROC曲線上分別找出這兩個miRNAs診斷腎細胞癌的臨界值，進一步計算這兩個miRNAs用于診斷腎細胞癌的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 腎細胞癌患者與良性腎病患者血漿中miRNA-21和miRNA-142-5p的表達水平

腎細胞癌組血漿中miRNA-21和miRNA-142-5p的表達水平均高于良性腎疾病組（P < 0.01）。見表1。

2.2 腎細胞癌患者血漿miRNA-21和miRNA-142-5p水平與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

腎細胞癌患者血漿miRNA-21的表達水平與患者的臨床分期相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。而血漿miRNA-142-5p的表達水平與患者的臨床病理學(xué)特征均未見明顯相關(guān)性（P > 0.05）。見表2。

2.3 miRNA-21、miRNA-142-5p的表達水平分別用于診斷腎細胞癌的ROC曲線

根據(jù)ROC曲線分析結(jié)果（圖1），miRNA-21診斷腎細胞癌的ROC曲線下面積（AUC）為0.826（標(biāo)準(zhǔn)誤0.041，95%CI：0.794～0.912）。取5.025為診斷腎細胞癌的臨界值，其相應(yīng)的敏感度和特異度分別為81.8%和83.7%。血漿miRNA-142-5p診斷腎細胞癌的AUC為0.805（標(biāo)準(zhǔn)誤0.051，95%CI：0.744～0.919）（圖2）。根據(jù)ROC曲線圖取miRNA-142-5p用于診斷腎細胞癌的臨界值為8.375，其相應(yīng)的敏感度和特異度分別為80.0%和77.6%，將miRNA-21、miRNA-142-5p二者聯(lián)合實驗，分別計算敏感度和特異度，診斷腎細胞癌的敏感性有所提高，為87.3%，但特異性略有下降，為75.5%。見表3。

2.4 腎細胞癌患者血漿miRNA-21、miRNA-142-5p的表達量的相關(guān)性分析

55例腎細胞癌患者血漿中miRNA-21、miRNA-142-5p表達量無明顯相關(guān)性（r = 0.184，P = 0.215）。

3 討論

目前腎細胞癌的治療以手術(shù)為主，腎細胞癌早期行根治性切除術(shù)大多可取到良好效果。但對于晚期或已發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，絕大多數(shù)已錯過手術(shù)時機。所以腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)與治療是降低其死亡率的關(guān)鍵，但多數(shù)腫瘤缺乏高敏感性和高特異性的標(biāo)志物[7]。miRNA的發(fā)現(xiàn)及其研究成果拓寬了對癌癥發(fā)生機制認知的視野。在腎細胞癌組織中，多個miRNA異常表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展等相關(guān)性研究已被報道。研究者發(fā)現(xiàn)miRNA-381、miRNA-30a、miRNA-199a等在腎細胞癌組織中呈低表達[8-11]，而miRNA-378、miRNA-30b、miRNA-106a、miRNA-222等在腎細胞癌組織及血液中呈高表達[12-15]。由于循環(huán)miRNA免于被RNA酶降解且在外周血中高度穩(wěn)定，且具有腫瘤相關(guān)性與組織特異性等特點[16]，故它們已被視為癌癥監(jiān)測中新的潛在生物標(biāo)志物[17]。

本實驗通過檢測腎細胞癌患者及良性腎臟疾病血漿中miRNA-21及miRNA-142-5p相對表達量的分析得出實驗組miRNA-21及miRNA-142-5p表達水平均高于對照組（P < 0.01），應(yīng)用受試者ROC曲線分析血漿中miRNA-21、miRNA-142-5p在腎細胞癌診斷中的價值，miRNA-21的AUC為0.826，靈敏度為81.8%，特異度為83.7%；miRNA-142-5p的AUC為0.805，靈敏度為80.0%，特異度為77.6%。因此，推測miRNA-21、miRNA-142-5p可以成為腎細胞癌的潛在生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果與目前一些研究的結(jié)果相符。如有研究提示，腎細胞癌患者血清中miRNA-21呈現(xiàn)高表達，ROC曲線下面積0.865（95%CI：0.766～0.965），根據(jù)ROC曲線分析結(jié)果已符合臨床應(yīng)用價值，是腎細胞癌可選的診斷標(biāo)志物[18]。段倞彥等[19]研究證實miRNA-21在腎細胞癌組織中呈高表達，其表達水平隨著細胞侵襲力的增高而升高。盡管近年來關(guān)于miRNA142-5p與腎細胞癌的相關(guān)性研究較少，趙爽等[6]研究miRNA-142-5p在腎細胞癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，證明其與腎細胞癌的發(fā)生與進展有關(guān)。Liu等[20]報道了miRNA-142-5p通過靶向BTG3基因刺激腎細胞癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移。

目前關(guān)于不同的miRNAs在同一腫瘤發(fā)生過程中的相互作用關(guān)系（協(xié)同或拮抗作用）的研究尚少。本研究就55例腎細胞癌患者血漿中的miRNA-21、miRNA142-5p之間的關(guān)系應(yīng)用相關(guān)性分析，得出miRNA-21及miRNA142-5p在腎細胞癌的發(fā)生發(fā)展中是兩個獨立因素，彼此無相關(guān)性。由于不同個體及腫瘤本身之間miRNAs的表達差異、標(biāo)本的采集、保存方式及實驗研究方法等原因不同，實驗結(jié)果可能不同，本試驗由于樣本數(shù)量較少，研究結(jié)果還需要通過進一步擴大樣本量以及進行多中心的臨床試驗來驗證。

綜上所述，腎細胞癌血漿miRNA-21、miRNA-142-5p的表達量較良性腎臟疾病患者呈現(xiàn)高表達，提示二者可能起到了類似癌基因的作用，有望成為腎細胞癌診斷的有臨床價值的微創(chuàng)生物標(biāo)志物。雖然腎細胞癌的確診依賴于病理組織學(xué)證據(jù)，但高敏感和高特異的血液腫瘤標(biāo)志物陽性高度提示腎細胞癌的可能性，可為進一步檢查以獲得病理組織學(xué)證據(jù)提供預(yù)警。

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（收稿日期：2018-02-08 本文編輯：李岳澤）