人源S100A8重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其對他莫昔芬治療乳腺癌的影響

汪彥陽，陶志嵩，徐 佩

南京鼓樓醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科 (南京 210000)

S100家族是一類低分子量(9～14 kD)的酸性蛋白質(zhì),是一類具有高度結(jié)構(gòu)同源性的鈣結(jié)合蛋白。在目前發(fā)現(xiàn)的21個家族成員中,S100A8、S100A9是比較重要的兩個, 該家族成員可高選擇性和高親和性地結(jié)合Ca2+Zn2+等離子,從而引起其結(jié)構(gòu)改變,使其與靶蛋白結(jié)合,調(diào)節(jié)靶蛋白的活性[1]。其中，S100A8在目前的研究中被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤的化療藥物耐藥性密切相關(guān)。S100A8可以通過促進自噬從而使白血病細胞發(fā)生化療耐藥[2]。而在乳腺癌的治療中，S100A8被發(fā)現(xiàn)與雌激素受體的缺失密切相關(guān)，同時，S100A8可以與S100A9形成復(fù)合物，而這類復(fù)合物分泌的增多又會造成乳腺癌細胞對多柔比星聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療的耐藥性[3-4]。S100A8很可能是造成乳腺癌治療耐藥性的重要分子。因此，本研究通過構(gòu)建人源S100A8的重組質(zhì)粒，從而深入探究S100A8與乳腺癌他莫昔芬耐藥的關(guān)系，為研究乳腺癌他莫昔芬耐藥的機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

含myc標(biāo)簽的載體pCMV5-myc，感受態(tài)細胞以及人乳腺癌細胞株MCF7均由南京醫(yī)科大學(xué)蘇東明教授饋贈；人源S100A8基因引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；Primer Star DNA聚合酶、內(nèi)切酶NdeⅠ和BamHⅠ以及T4 DNA 連接酶均購自日本Takara公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；小量膠回收試劑盒與質(zhì)粒純化試劑盒購自美國Axygen公司；S100A8、BCL2、GAPDH抗體購自美國Proteintech公司，MTT試劑盒購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的提取、酶切、連接、轉(zhuǎn)化以及細菌感受態(tài)的制備 具體操作詳見參考文獻[5]。

1.2.2 人源S100A8基因cDNA片段的獲得 以人源S100A8基因cds區(qū)為模板， 設(shè)計引物并合成，利用高保真酶Primer Star DNA 聚合酶進行PCR擴增。上游引物：5'-GGAATTCCATATGATGT TGACCGAGCTGGAG-3'；下游引物：5'-CGGGA TCCCTACTCTTTGTGGCTTTCTT-3'(上下游引物5'端分別引入NdeⅠ和BamHⅠ的酶切位點)。擴增條件為：98 ℃預(yù)變性5 min，接著98 ℃ 10 s→55 ℃退火15 s→72 ℃延伸1 min(30個循環(huán))，接著72 ℃繼續(xù)延伸10 min。擴增完成后，按小量膠回收試劑盒與質(zhì)粒純化試劑盒說明進行切膠回收獲得純化目的片段。

1.2.3 細胞培養(yǎng) MCF7細胞株培養(yǎng)在含10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液內(nèi)。MCF7細胞采用培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板培養(yǎng)于5%CO2、37 ℃的恒濕培養(yǎng)箱中。

1.2.4 重組質(zhì)粒的細胞轉(zhuǎn)染以及蛋白表達鑒定 采用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 分別轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒pCMV5-myc以及重組質(zhì)粒pCMV5-myc-S100A8到MCF7細胞中，具體操作詳見參考文獻[6]。轉(zhuǎn)染24 h后，用蛋白裂解液裂解細胞并收集總蛋白，之后通過Western Blot的方法進行檢測[5]。本研究使用的抗體的稀釋濃度為：anti-S100A8(1∶1 000)，anti-GAPDH(1∶4 000)，anti-BCL2(1∶1 000)。

1.2.5 MTT檢測細胞活力 使用美國Sigma公司的MTT檢測試劑盒進行檢測，具體操作詳見相關(guān)參考文獻[7]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

2.1.1 S100A8基因cDNA片段的獲得 通過PCR反應(yīng)，獲得長度為354 bp的人源S100A8基因cDNA片段。

2.1.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定與測序 重組質(zhì)粒pCMV5-myc-S100A8構(gòu)建成功后用NdeⅠ和BamHⅠ進行酶切鑒定。雙酶切后產(chǎn)生兩個片段，其大小分別為4 321 bp以及354 bp左右，與設(shè)想的結(jié)果相一致。將構(gòu)建好的質(zhì)粒委托上海華大測序公司進行DNA測序分析，結(jié)果與目的片段完全一致，沒有任何突變，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒pCMV5-myc-S100A8的酶切鑒定

注：1：pCMV5-myc；2：pCMV5-myc-S100A8； M：Marker

2.1.3 重組質(zhì)粒在人乳腺癌細胞株MCF7中的表達鑒定 將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF7細胞，用蛋白裂解液裂解細胞提取細胞總蛋白，通過Western Blot方法驗證pCMV5-myc-S100A8在人乳腺癌細胞株中成功表達S100A8蛋白(圖2)。

圖2S100A8重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人乳腺癌細胞株MCF7的表達鑒定

注：1：轉(zhuǎn)染pCMV5-myc對照組； 2：轉(zhuǎn)染pCMV5-myc-S100A8組

2.2 過表達S100A8對人乳腺癌細胞株的影響

2.2.1 過表達S100A8可以部分逆轉(zhuǎn)他莫昔芬造成的細胞活力下降 在MCF7細胞中，分別梯度轉(zhuǎn)染S100A8重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24 h后用5 μM的他莫昔芬以及其溶劑DMSO對照處理細胞，處理24 h后，用MTT法檢測細胞活力。結(jié)果顯示：S100A8可以梯度逆轉(zhuǎn)由他莫昔芬造成的MCF7細胞活力下降(圖3)。

圖3 過表達S100A8部分逆轉(zhuǎn)他莫昔芬造成的MCF7細胞活力下降

注： ##表示他莫昔芬處理的對照組與DMSO處理的對照組相比；*表示他莫昔芬處理的過表達組與他莫昔芬處理的對照組相比；**表示他莫昔芬處理的過表達組與他莫昔芬處理的對照組相比

2.2.2 S100A8通過BCL2部分逆轉(zhuǎn)他莫昔芬造成的效應(yīng) 在MCF7細胞中分別梯度過表達S100A8，轉(zhuǎn)染24 h后，再用5 μM他莫昔芬處理24 h，之后收取細胞總蛋白，用Western Blot的方法檢測BCL2、S100A8的蛋白表達。本研究發(fā)現(xiàn)梯度過表達S100A8在他莫昔芬的處理下，可以梯度升高BCL2的蛋白表達水平(圖4)。

圖4過表達S100A8通過BCL2部分逆轉(zhuǎn)他莫昔芬對MCF7細胞的效應(yīng)

3 討論

近年來，乳腺癌的發(fā)病率逐漸提高，成為女性最常見的罹患腫瘤。而其中，有大約50%的雌激素受體陽性的乳腺癌病人會在接受他莫昔芬以及其他芳香酶抑制劑類化療藥物之后發(fā)生復(fù)發(fā)或者耐藥[8]。

S100A8這個S100的重要家族成員越來越被現(xiàn)今的研究者關(guān)注。作為一種鈣結(jié)合蛋白，它可以高選擇性和高親和性地結(jié)合Ca2+Zn2+等離子,從而引起其結(jié)構(gòu)改變,使其與靶蛋白結(jié)合,調(diào)節(jié)靶蛋白的活性[9-11]。而同時，已有研究[3,12]證明，S100A8與乳腺癌治療過程中發(fā)生缺失相關(guān)。Bao等[3]曾報道，在MCF7細胞中，S100A8/A9的表達與雌激素受體的表達呈負相關(guān)，高表達的S100A8/A9能夠抑制雌激素受體的mRNA水平從而降低雌激素受體的表達。同時，體外實驗[3]表明，在MCF7細胞中長期高表達S100A8/A9會使雌激素受體的表達發(fā)生缺失，其具體的分子機制有待進一步探究。研究[2]表明，S100A8與各類腫瘤經(jīng)過化療后發(fā)生耐藥以及復(fù)發(fā)有關(guān)，而其中機制又各不相同。例如，在白血病細胞中，S100A8是通過促進自噬從而使其發(fā)生耐藥。但是，在乳腺癌細胞中，研究者[3-4, 13]發(fā)現(xiàn)，S100A8可以和S100A9結(jié)合形成復(fù)合物，而這種復(fù)合物又是乳腺癌細胞對多柔比星聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療發(fā)生耐藥的原因。在腫瘤細胞中，存在一個CXCL1/2-S100A8/S100A9的環(huán)形通路，該通路是腫瘤細胞的生存軸，將腫瘤細胞的耐藥與侵襲密切聯(lián)系在一起，尤其在乳腺癌細胞中，當(dāng)使用化療藥物時，該通路會被高度激活。

臨床上大部分雌激素受體陽性的乳腺癌患者會使用他莫昔芬這種藥物進行治療，而該藥物發(fā)生耐藥性的病例也非常普遍[14-16]。鑒于S100A8與雌激素受體的關(guān)聯(lián)以及與腫瘤耐藥性的發(fā)生息息相關(guān)，因此，本研究構(gòu)建了S100A8的重組質(zhì)粒并且在雌激素受體陽性的乳腺癌細胞株MCF7中進行了初步探究，以期能深入探索S100A8在他莫昔芬耐藥的乳腺癌細胞中的分子機制。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建好攜帶myc標(biāo)簽的S100A8重組質(zhì)粒，并成功在MCF7細胞中表達。同時，本研究的結(jié)果顯示，在梯度過表達S100A8之后，用5 μM他莫昔芬處理，可以梯度逆轉(zhuǎn)他莫昔芬對乳腺癌細胞造成的細胞活力下降。而在分子水平，在MCF7細胞中梯度過表達S100A8，同時用5 μM他莫昔芬處理，其抗凋亡分子BCL2的表達水平也梯度升高。因此，S100A8與雌激素受體的乳腺癌他莫昔芬耐藥有一定關(guān)聯(lián)。S100A8的重組質(zhì)粒為闡明其耐藥機制以及尋找早治療靶點奠定了基礎(chǔ)。