均勻設計優(yōu)化白參菌多糖硫酸酯化修飾條件

董 昊，包彥強，韓鵬虎，蔣志悅，韓麗琴

(吉林醫(yī)藥學院藥學院,吉林 吉林 132013)

多糖是生物體內除蛋白質和核酸外的一類大分子物質，具有抗氧化、抗衰老、調節(jié)機體免疫、抗癌等作用[1-2]。化學基團的引入可以明顯改善多糖的溶解度[3]，常常會增強多糖的活性或使多糖產(chǎn)生新的活性[4-5]。硫酸酯化多糖是指多糖中的羥基被硫酸基所取代，從而發(fā)生結構的改變，具有更強的抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗凝血等作用[6]。白參菌，又名裂褶菌、白花，是一種食藥兼用的珍稀菇菌。白參菌富含鋅、鐵、鉀、鈣、磷、硒、鍺，而且有較高的藥用價值，能防治神經(jīng)衰弱、清肝明目、健胃、潤肺、抗癌、抗炎癥[7]。白參菌多糖是白參菌發(fā)揮作用的主要有效成分之一。白參菌多糖能顯著抑制腫瘤生長，使化療后引起的白細胞下降得到較快回升;可恢復老年動物細胞免疫及體液免疫的功能，對延緩衰老也可能有一定意義[8-9]。本研究采用均勻實驗分析方法，從而得到白參菌多糖硫酸酯化的最佳修飾條件，為進一步研究其功能與生理活性打下基礎。

1 材料與方法

1.1 研究材料

白參菌多糖(自制)，無水乙醇，硫酸，氨基磺酸，二甲基亞砜，乙二胺四乙酸二鈉，其余試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

儀器JB-3定時恒溫磁力攪拌器；FA1104N電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；800電動離心機；T6新世紀紫外可見分光光度計；Verterx70型傅里葉變換紅外光譜儀。

1.2 多糖的修飾

取一定量純化的白參菌多糖于三頸燒瓶中，加入甲酰胺，攪拌使其完全溶解，加入適量的氨基磺酸，在一定溫度下進行反應，然后用10%NaOH調pH至7.0～8.0，加入3倍量的95%乙醇醇沉24 h，離心，收集沉淀，沉淀復溶，用3500的透析袋透析72 h，再對透析液進行濃縮，冷凍干燥，即得硫酸酯化修飾后的白參菌多糖[10]。多糖修飾后取代度測定標準曲線的繪制[10]。

1.3 多糖修飾后取代度測定標準曲線的繪制

準確吸取1 g/L的標準硫酸鈉溶液0.02、0.06、0.10、0.14、0.18、0.20 mL,于具塞試管中，以1 mol/L的鹽酸溶液補至0.20 mL,用0.20 mL的鹽酸溶液作為空白，分別加入三氯乙酸3.8 mL及氯化鋇-明膠溶液1.0 mL，搖勻靜置15 min(室溫)。于360 nm波長處，測得吸光度A1，再以1.0 mL的明膠溶液代替氯化鋇-明膠溶液，測吸光度A2，以硫酸基濃度為橫坐標，以吸光度(A1-A2)為縱坐標繪圖[11]。

1.4 樣品取代度的測定

準確稱取10 mL修飾后的多糖，加入到50 mL容量瓶中，加入1 mol/L鹽酸溶液，于100 ℃下反應3 h后終止反應。用1 mol/L鹽酸溶液定容至50 mL，搖勻，離心取上清液，測定硫酸根的含量。白參菌多糖的硫酸根取代度的計算公式為[12]:

DS=1.62S/(32-1.02S)

1.5 均勻實驗設計

本實驗采用均勻設計實驗U10(53)來安排實驗，考察溫度、時間、投料比(氨基磺酸質量/多糖質量)5個因素對硫酸基取代度的影響，每個因素取5個水平，優(yōu)化白參菌多糖硫酸酯化具體條件見表1[13]。

表 1 因素水平設計

2 結果與分析

2.1 修飾前后多糖紅外光譜圖的比較

白參菌多糖修飾前后的紅外光譜如圖1、2所示，多糖在3200～3500 cm-1的寬峰是O-H伸縮振動；2900 cm-1左右的吸收峰為糖類C-H伸縮振動；1000～1200 cm-1的吸收峰是由兩種C-O伸縮振動所引起的；糖環(huán)形態(tài)為吡喃糖環(huán)[14-15]。修飾后的白參菌多糖，其中3200～3500 cm-1的吸收峰為多糖中-OH的吸收峰的變窄，說明羥基數(shù)量有所減少。在1700 cm-1附近有一明顯的吸收峰,該峰-OSO3的S=O伸縮振動吸收峰,這表明硫酸中的硫酸基已被轉移到了白參菌多糖中，形成了新的化學鍵。

圖 1 白參菌多糖的紅外光譜圖

圖 2 硫酸酯化白參菌紅外光譜圖

2.2 均勻實驗結果及分析

白參菌多糖修飾均勻實驗結果見表2,數(shù)據(jù)處理結果見表3。

表2數(shù)據(jù)采用均勻設計實驗處理軟件DPS8.0進行二次多項式逐步回歸分析[16]得到擬合方程：

Y=-25.193 5-0.624 5×X1+8.788 1×X2+

0.124 2×X1×X2-0.066 7×X1×X3

式中Y為硫酸根取代度，X1為反應溫度，X2為反應時間，X3為投料比。

擬合方程的P=0.002，方程有顯著意義；剩余標準殘差SSE=0.009 4，調整后的相關系數(shù)R為0.998 7。從表3可以看出時間和投料比與硫酸根的取代度成正相關，而溫度則成負相關。因此，在實驗中可以增加反應時間，增大投料比，降低反應溫度，以使硫酸根的取代度達到最大。

根據(jù)回歸方程，得到的最優(yōu)組合為反應溫度50.2 ℃，反應時間2.18 h，投料比為2.15∶1。

表 2 均勻實驗設計結果

表 3 二次多項式逐步回歸數(shù)據(jù)處理結果

2.3 驗證性試驗

在反應溫度50.2 ℃、反應時間2.18 h、投料比為2.15∶1的條件下，稱取干燥至恒重的白參菌多糖3份各2.0 g，平行進行3次酯化操作，得到3份硫酸酯化的白參菌多糖，其取代度分別為0.453、0.460、0.458，與均勻設計結果的差異不顯著。驗證實驗說明均勻實驗設計方法篩選的白參菌多糖硫酸酯化工藝可靠、穩(wěn)定。

3 討 論

采用均勻設計實驗分析方法優(yōu)化實驗條件，能通過較少的實驗次數(shù)囊括較多的實驗因素，利用軟件進行回歸分析，提高了分析結果的準確度，確定了最佳修飾條件，驗證實驗更加表明均勻實驗能較好地擬合反應體系。

采用氨基磺酸法進行白參菌多糖的硫酸酯化修飾，相比于其他實驗方法毒性更小，而且反應條件溫和，便于控制反應過程，取得與其他方法相似的取代度[15,17]，說明該方法的實用性較好，可行性較高。