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    桉葉油含藥血清聯(lián)合維甲酸對體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞Pax3及Cx43的影響*

    2018-11-15 02:21:30胡曉芳余永莉張彬渝劉茂生蘇麗莉遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室廣東珠海519041
    現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生 2018年21期
    關(guān)鍵詞:桉葉油胎鼠含藥

    胡曉芳,余永莉,陳 濤,張彬渝,劉茂生,蘇麗莉(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室,廣東珠海519041)

    桉葉油是從桉樹葉中提取的具有芳香味的揮發(fā)性油,具有抗菌、抗氧化、抗炎、促滲透、殺蟲、驅(qū)蚊、止癢及防腐作用[1]。有文獻(xiàn)報道,桉葉油能舒張氣管和血管平滑肌、心肌,其作用機(jī)制可能是影響膜上離子通道的離子流[2-4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),桉葉油對維甲酸(RA)導(dǎo)致胎鼠神經(jīng)管缺陷有一定的拮抗作用,其機(jī)制可能與桉葉油拮抗RA上調(diào)胎鼠神經(jīng)組織的Pax3、Cx43蛋白過度表達(dá)有關(guān)。本研究利用桉葉油制備含藥血清,聯(lián)合RA作用體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞,通過檢測細(xì)胞Pax3、Cx43基因表達(dá)水平,從體外實驗探討桉葉油是否也具有拮抗RA上調(diào)胎鼠神經(jīng)組織的Pax3、Cx43蛋白表達(dá)的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物 選擇SPF級SD大鼠,體重180~220 g[購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心,實驗動物合格證號編號:0094460,許可證號:SCXK(粵)2008-0002];飼養(yǎng)條件:室溫24~27℃,通風(fēng),相對濕度68%~80%,每天光照12 h,自由攝食、飲水。

    1.1.2 藥品及試劑 RA粉末原料藥(北京貝利萊斯生物化學(xué)有限公司,批號:110801),桉葉油[桉葉素99.5%,德信行(珠海)香精香料有限公司,批號:110626];選用金龍魚花生油作為藥品溶劑。

    1.2 方法

    1.2.1 桉葉油含藥血清的制備 選擇體重250~300 g清潔級的雄性SD大鼠,將其隨機(jī)分為6組,每組3只,分別作為正常血清組(大鼠自由飲食)、溶劑血清對照組(每只大鼠早晨灌胃花生油3 mL,每天1次,連續(xù)灌胃 7 d)、桉葉油血清組(分別用桉葉油 300、1 000、1 500 mg∕kg 于早晨灌胃,每天 1 次,連續(xù)灌胃 7 d)。各組末次灌胃后2.5 h左右,用10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉,解剖胸腔,用一次性無菌注射器心臟采血,離心,收集血清。無菌濾器過濾除菌,置于56℃水浴30 min滅活,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 在無菌條件下取24 h內(nèi)新生SD大鼠的海馬組織,輕微機(jī)械吹打組織,用200目過濾網(wǎng)過濾、收集單細(xì)胞懸液。加入適量DMEM∕F12 全培養(yǎng)液[內(nèi)含 2% 維生素 B27、20 μg∕L 成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)和 20 μg∕L 表皮生長因子(EGF)],放入37℃、5%CO2飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中換液培養(yǎng)7 d,傳代1次,收集第2代神經(jīng)干細(xì)胞,輕微吹打、吹散細(xì)胞球,制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105mL-1接種于6孔培養(yǎng)板,每孔4 mL,分為BrdU標(biāo)記組和對照組。BrdU 標(biāo)記組加入 BrdU 10 μmol∕L,對照組加入 DMEM∕F12全培養(yǎng)液,培養(yǎng)48 h收集各孔細(xì)胞,用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞后,采用免疫熒光法檢測BrdU、Nestin。鑒定BrdU組一抗為兔抗鼠BrdU抗體,鑒定Nestin組一抗為兔抗鼠Nestin抗體,兩組二抗均為羊抗兔異硫氰酸熒光素-免疫球蛋白G(FITC-IgG)。并設(shè)立一抗為磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的陰性對照組。使用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

    1.2.3 桉葉油含藥血清對體外培養(yǎng)胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞Pax3、Cx43表達(dá)的影響 收集第二代神經(jīng)球細(xì)胞,加入新的無血清DMEM∕F12全培養(yǎng)液,輕微吹打、吹散細(xì)胞球,制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105mL-1接種于培養(yǎng)板,分為5組,分別加入自由飲食SD大鼠血清、溶劑花生油灌胃血清、桉葉油 1 500、1 000、300 mg∕kg灌胃鼠血清,各組血清終濃度為5%。各組細(xì)胞放入37℃、5%CO2、飽和濕度條件下CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞,采用蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測細(xì)胞Pax3、Cx43蛋白表達(dá)水平,并采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測細(xì)胞Pax3、Cx43基因表達(dá)水平。

    1.2.4 桉葉油含藥血清聯(lián)合RA對體外培養(yǎng)胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞Pax3、Cx43表達(dá)的影響 收集第2代神經(jīng)球細(xì)胞,加入新的無血清DMEM∕F12全培養(yǎng)液,輕微吹打、吹散細(xì)胞球,制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105mL-1接種于6孔培養(yǎng)板,分為6組,正常SD大鼠血清5%+RA(5 μmol∕L),溶劑花生油含藥血清 5%+RA(5 μmol∕L),桉葉油 1 500 mg∕kg 含藥血清 5%+RA(5 μmol∕L),1 000 mg∕kg 含藥血清 5%+RA(5 μmol∕L)、300 mg∕kg 含藥血清 5%+RA(5 μmol∕L),RA(5μmol∕L)。各組細(xì)胞放入37℃、5%CO2飽和濕度條件下CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞,采用Western blotting檢測細(xì)胞Pax3、Cx43蛋白表達(dá)水平,并采用RT-PCR檢測細(xì)胞Pax3、Cx43基因表達(dá)水平。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計量資料以表示,各組均數(shù)比較采用方差分析。檢測水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 收集新生SD大鼠海馬組織細(xì)胞在無血清的DMEM∕F12全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后,肉眼可見培養(yǎng)瓶中有乳白色小塊狀或者顆粒狀懸浮物,鏡下觀察懸浮物為聚集的細(xì)胞塊,細(xì)胞輪廓清晰,有光澤,其周圍有懸浮的死細(xì)胞碎片,瓶底也有大量有光澤的單個細(xì)胞。換液后吹散懸浮小塊繼續(xù)培養(yǎng),如此換液吹散培養(yǎng)到第7天,可見大量大小不等的神經(jīng)細(xì)胞球。收集第2代細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果顯示Nestin、Brdu表達(dá)呈陽性(圖1),整個培養(yǎng)過程中無細(xì)胞貼壁現(xiàn)象出現(xiàn)。

    2.2 桉葉油含藥血清對體外培養(yǎng)胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞Pax3、Cx43蛋白及mRNA表達(dá)的影響 用5%的血清作用細(xì)胞后,桉葉油含藥血清各組細(xì)胞的Cx43蛋白及基因表達(dá)水平較正常血清組的表達(dá)水平均高(P<0.05),Pax3蛋白及基因表達(dá)水平較正常血清組的表達(dá)水平均低(P<0.05)。見圖2、表1。

    圖1 神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定(200×)

    圖2 桉葉油含藥血清作用神經(jīng)干細(xì)胞48 h Pax3、Cx43蛋白表達(dá)水平

    表1 桉葉油含藥血清作用神經(jīng)干細(xì)胞48 h Pax3、Cx43基因表達(dá)水平相對正常血清組Pax3、Cx43基因表達(dá)改變情況

    2.3 桉葉油含藥血清聯(lián)合維甲酸對體外培養(yǎng)胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞Pax3、Cx43蛋白及mRNA表達(dá)的影響 用5%的血清+RA作用細(xì)胞后,與單純RA組比較,血清各組Pax3蛋白及mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05);桉葉油含藥血清各組的Pax3蛋白及mRNA較正常血清組表達(dá)水平均有差異(P<0.05)。

    用5%的血清+RA作用細(xì)胞后,與單純RA組比較,血清各組Cx43蛋白及mRNA表達(dá)水平均降低;但在5%的血清+RA各組中,桉葉油各組Cx43蛋白及其mRNA與正常血清組比較無顯著差異(P>0.05)。結(jié)合單純桉葉油血清可上調(diào)細(xì)胞的Cx43蛋白及其mRNA表達(dá),但與RA聯(lián)合后,其對神經(jīng)干細(xì)胞Cx43的影響與正常血清組比較無顯著差異(P>0.05)。見圖3、表2。

    圖3 桉葉油含藥血清聯(lián)合維甲酸作用神經(jīng)干細(xì)胞48 h Pax3、Cx43蛋白表達(dá)水平

    表2 桉葉油含藥血清聯(lián)合RA作用體外培養(yǎng)胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞48 h Pax3、Cx43 mRNA相對RA組Pax3、Cx43 mRNA表達(dá)水平改變情況

    3 討 論

    RA是維生素A在體內(nèi)氧化代謝的產(chǎn)物,具有多種生物學(xué)功能,在胚胎生長發(fā)育過程中對胚胎的形成、細(xì)胞生長與分化起重要的調(diào)節(jié)作用。RA是一種很強(qiáng)的誘導(dǎo)分化劑,可誘導(dǎo)300多種功能蛋白質(zhì)的表達(dá)。已有文獻(xiàn)報道,小劑量RA可誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)元。鐘德君等[5]觀察不同濃度的RA在鼠胚神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化中的作用,發(fā)現(xiàn)RA具有顯著地促進(jìn)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)分化為神經(jīng)元的作用,且 1.0 μmol∕L RA 誘導(dǎo)分化效果最佳。蔣震偉等[6]用 10 μmol∕L RA 處理人胚神經(jīng)干細(xì)胞后,將神經(jīng)干細(xì)胞移植入受損的大鼠脊髓內(nèi),發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)能替代缺失的神經(jīng)元,能促進(jìn)受損的脊髓功能恢復(fù)。然而,RA也是致畸因子,過量的RA可導(dǎo)致實驗動物的神經(jīng)管畸形、腭裂、骨質(zhì)疏松等等多種畸形。蔡煒嵩等[7]利用RA灌胃造大鼠神經(jīng)管畸形動物模型觀察其出現(xiàn)神經(jīng)組織畸胎瘤、脊髓裂開、脊柱裂等畸形形態(tài)學(xué)特點(diǎn),發(fā)現(xiàn)RA可干擾神經(jīng)發(fā)育導(dǎo)致脊柱裂、脊髓裂開和神經(jīng)錯構(gòu)瘤的發(fā)生。李紅麗等[8]用RA建立小鼠神經(jīng)管畸形模型,體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞并檢測其增殖變化,發(fā)現(xiàn)胚胎早期神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)目減少及神經(jīng)細(xì)胞增殖受抑制與RA致神經(jīng)管畸形的發(fā)生有密切關(guān)系。由于胚胎畸形發(fā)生是先天性的,一旦發(fā)生后具有不可逆性,故其治療方法主要以預(yù)防性治療為主。不少學(xué)者利用RA造胚胎致畸模型,通過研究藥物對其的拮抗作用,來尋找有效預(yù)防治療先天畸形的方法。本課題組前期研究中利用桉葉油聯(lián)合RA灌胃SD孕鼠,探討其在預(yù)防性治療胚胎畸形中是否具有藥用價值,結(jié)果發(fā)現(xiàn),桉葉油對RA引起胎鼠畸形,生長發(fā)育遲緩,骨骼發(fā)育及骨化遲緩有一定的拮抗作用[9-10],對胎鼠腦組織的Cx43、Pax3蛋白和基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)RA組胎鼠神經(jīng)組織的Pax3、Cx43蛋白過度表達(dá),桉葉油具有拮抗RA上調(diào)胎鼠神經(jīng)組織的Pax3、Cx43蛋白表達(dá)的作用,但其具體機(jī)制尚不清楚。

    Cx43是縫隙連接蛋白家族的重要成員,也是脊椎動物中表達(dá)最多、最廣泛的縫隙連接蛋白。縫隙連接又稱通訊連接,是細(xì)胞間物質(zhì)交換和信息傳遞的通道。該通道允許離子、小分子物質(zhì)等自由通過,傳遞細(xì)胞間的信息和能量,對細(xì)胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細(xì)胞增殖、分化、生長調(diào)控等各方面起著重要作用。在神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)尚未建立或未發(fā)育完善的早期胚胎,長距離的信息傳遞難以進(jìn)行,胚胎各部分細(xì)胞的增殖、分化與生長發(fā)育離不開細(xì)胞間離子信息的交換,縫隙連接異常將導(dǎo)致細(xì)胞分化遷移異常。有研究表明,Cx43表達(dá)及其縫隙連接功能的異常與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程有密切的聯(lián)系[11]。REAUME等[12]發(fā)現(xiàn),Cx43無義突變可造成信息傳遞缺陷,影響神經(jīng)細(xì)胞的遷移、增生及細(xì)胞凋亡過程。喻博等[13]用體外培養(yǎng)的胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植治療大鼠腦損傷,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞移植對腦損傷的恢復(fù)有一定作用,且與CX43的表達(dá)水平有關(guān)。WATANABE等[14]研究認(rèn)為,過量RA是通過增加Cx43 mRNA的表達(dá)上調(diào)Cx43蛋白的表達(dá),使信息傳遞發(fā)生紊亂,從而阻止細(xì)胞生長。本研究用5 μmol∕L RA作用神經(jīng)干細(xì)胞48 h,也發(fā)現(xiàn)RA具有上調(diào)細(xì)胞Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)的作用,5%桉葉油含藥血清聯(lián)合RA作用細(xì)胞48 h后,細(xì)胞的Cx43 mRNA及蛋白表達(dá)與單純RA組比較均顯著降低,提示桉葉油含藥血清具有拮抗RA上調(diào)細(xì)胞Cx43 mRNA及其蛋白表達(dá)的作用,而單純的5%桉葉油含藥血清作用神經(jīng)干細(xì)胞48 h后,細(xì)胞的Cx43 mRNA及其蛋白表達(dá)水平增加,此結(jié)果進(jìn)一步證明桉葉油含藥血清對RA上調(diào)細(xì)胞Cx43表達(dá)有拮抗作用,而非協(xié)同作用。Pax3基因?qū)儆赑ax基因家族,是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,在胚胎發(fā)育過程中對組織和器官的分化起著重要的調(diào)控作用。STOYKOVA等[15]研究發(fā)現(xiàn),在神經(jīng)管細(xì)胞開始分化之前,在整個神經(jīng)管軸的頂板、側(cè)翼板及神經(jīng)嵴細(xì)胞均有表達(dá)Pax3基因已表達(dá)。Pax3表達(dá)過高或過低均可導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生,WU等[16]研究證明,神經(jīng)嵴細(xì)胞中Pax3的持續(xù)高表達(dá)會導(dǎo)致小鼠腭裂和骨畸形。ZHOU等[17]研究發(fā)現(xiàn),Pax3能調(diào)節(jié)Soostdc1的表達(dá)從而阻止神經(jīng)嵴對骨形成蛋白的誘導(dǎo),導(dǎo)致胚胎出現(xiàn)脊柱裂或腦膨出。BURREN等[18]研究發(fā)現(xiàn),葉酸缺乏可致小鼠Pax3功能喪失,從而導(dǎo)致神經(jīng)管畸形。王濤等[19]用RA及牛磺酸建立小鼠神經(jīng)管畸形及干預(yù)模型,發(fā)現(xiàn)RA的致畸作用與Pax3基因表達(dá)的時相差異性有關(guān)。KENNEDY等[20]用低劑量的RA處理P19或小鼠胚胎干細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)RA是通過上調(diào)Wnt3a、PAX3、Meox1、MyoD 和 Myogenin的表達(dá),實現(xiàn)骨骼肌的成肌增強(qiáng)。本研究用5 μmol∕L RA作用神經(jīng)干細(xì)胞48 h后,細(xì)胞的Pax3的表達(dá)也是增加的,RA聯(lián)合5%的桉葉油含藥血清作用細(xì)胞48 h后,細(xì)胞的Pax3蛋白及mRNA表達(dá)水平均降低,提示桉葉油含藥血清具有拮抗RA上調(diào)細(xì)胞Pax3蛋白和mRNA表達(dá)的作用。

    本研究表明,RA具有上調(diào)神經(jīng)干細(xì)胞Cx43、Pax3的表達(dá),桉葉油含藥血清具有拮抗RA上調(diào)神經(jīng)干細(xì)胞Cx43、Pax3表達(dá)的作用。此結(jié)論與本課題組前期體內(nèi)實驗研究結(jié)論一致,從而進(jìn)一步證明了影響Cx43、Pax3的表達(dá)可能是桉葉油含藥血清具有拮抗RA致畸作用的機(jī)制之一。

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