布地奈德對哮喘小鼠IL-17表達的影響

張艷霞，王文革

（中國人民解放軍空軍總醫(yī)院 兒科，北京100142）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是由各種炎癥細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥疾病，其發(fā)病機制極為復(fù)雜，目前尚未完全清楚。哮喘病理變化主要包括3種特征性表現(xiàn)：氣道慢性炎癥、氣流受阻及氣道高反應(yīng)，其中氣道慢性炎癥被認為是哮喘的本質(zhì)。近年研究發(fā)現(xiàn)[1]在各種免疫反應(yīng)如自身免疫、宿主防御病原體及炎癥反應(yīng)中，白細胞介素17（IL-17）均參與其免疫調(diào)節(jié)機制。IL-17可以介導(dǎo)中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等炎癥細胞在氣道中聚集，加重哮喘的氣道炎癥，從而參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展，也可以抑制炎癥，在哮喘的氣道中起負性調(diào)節(jié)作用。目前IL-17在哮喘中起促炎還是抑炎的作用尚未明確。吸入性糖皮質(zhì)激素（inhaled corticosteroids, ICS）可以減少細胞因子及炎癥細胞在氣道中的聚集、浸潤[2]，是長期控制哮喘的有效藥物，其中布地奈德為其代表性藥物[3]。目前關(guān)于布地奈德治療哮喘作用機制的研究主要涉及通過干預(yù)IL-1、IL-10、IL-5、IL-23等細胞因子的表達，而對IL-17表達影響的研究較少。本研究利用哮喘小鼠模型，研究哮喘小鼠中IL-17的表達，經(jīng)布地奈德干預(yù)后，哮喘小鼠IL-17表達的變化。進而探討IL-17在哮喘發(fā)病機制中的作用以及布地奈德控制哮喘的作用機制與IL-17的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

布地奈德混懸液（1 mg/2 ml，LOT320888）購自上海阿斯利康制藥有限公司，十二水硫酸鋁鉀（237086）、卵清蛋白（Ovalbumin, OVA，A5253～250 g，純度≥98%）購自美國Sigma公司，HE及AB-PAS染色試劑盒購自武漢谷歌生物公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）IL-17試劑盒購自美國eBioscience公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，氯仿、異丙醇、無水乙醇均購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司，DEPC水購自北京索萊寶科技有限公司，TIAN Script RT KIT、Super Real Pre Mix Plus（SYBR Green）均購自天根生化科技（北京）有限公司。壓縮空氣式霧化機購自江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司。引物序列由上海生工生物工程有限公司設(shè)計。

1.2 實驗動物

SPF級雌性BALB/c小鼠24只，4周齡，體重（13±1）g，購自北京斯貝福實驗動物科技有限公司[SCXK（京）2016-0004]，小鼠飼養(yǎng)于中國人民解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院（304醫(yī)院）實驗動物房。其余實驗于中國人民解放軍空軍總醫(yī)院臨床航空醫(yī)學(xué)實驗室完成。

1.3 模型復(fù)制

復(fù)制哮喘小鼠模型，參考文獻[4-5]并加以改進。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，經(jīng)隨機數(shù)表法分為正常組、哮喘組及布地奈德組，每組8只。哮喘組與布地奈德組每只小鼠分別于飼養(yǎng)的第8、15、22天腹腔注射OVA致敏液0.2 ml[（內(nèi)含十二水硫酸鋁鉀1 mg，OVA 100 μg，磷酸鹽緩沖液（PBS）0.2 ml）]致敏。正常組小鼠腹腔只注射PBS。哮喘組及布地奈德組分別自飼養(yǎng)的第29天開始以5%OVA溶液霧化激發(fā)，正常組以PBS霧化吸入，1次/d，30 min/次，連續(xù)激發(fā)14 d后，布地奈德組在5% OVA激發(fā)前30 min給予布地奈德混合液4 ml（布地奈德混懸液1 mg/2 ml、生理鹽水2 ml）霧化吸入30 min。正常組及哮喘組小鼠均同時給予等量的生理鹽水。

1.4 取材

小鼠末次給予OVA、布地奈德混懸液霧化吸入后，禁食24 h，24 h后用1%戊巴比妥腹腔注射麻醉，引頸處死后，切開頸部及胸部皮膚，逐層分離組織，充分暴露氣管及雙肺，于氣道的上段做一橫向切口，以21 G的注射器針頭做氣管插管并固定，結(jié)扎右肺，將0.3 ml的PBS溶液緩慢灌注左肺并緩慢回抽灌洗液，重復(fù)灌洗3次，回收率為80%。將收集的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）以1 500 r/min，4℃離心10 min，回收上清液置入-80℃冰箱冷凍保存。取右肺-80℃冰箱冷凍保存。

1.5 小鼠肺組織病理切片的制備

收取BALF后，分離小鼠右肺，取約為1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm大小的肺組織，將其浸潤于4%多聚甲醛中固定48 h，石蠟包埋，行小鼠肺組織切片，厚度約3 μm，行AB-PAS及HE染色，顯微鏡下觀察小鼠肺組織中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等炎癥細胞浸潤情況，同時觀察支氣管管腔狹窄、氣道中杯狀細胞增生等典型的哮喘病理學(xué)改變。對各組肺組織進行病理學(xué)分級評分[6-7]，0分：無炎癥細胞；1分：少許炎癥細胞；2分：炎癥細胞形成環(huán)狀，層厚為1個細胞；3分：大量分布均勻的炎癥細胞，或炎癥細胞形成環(huán)狀，層厚為2～4個細胞；4分：大量炎癥細胞聚集成團，或炎癥細胞成環(huán)狀，層厚＞4個細胞。

1.6 BALF中IL-17表達水平的檢測

采用ELISA檢測BALF中IL-17的表達水平，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行，每個樣本和標準品均設(shè)2個復(fù)孔。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測小鼠肺組織中IL-17的表達

IL-17正向引物5'-AAGGCAAATACGGTGGTG TG-3'，反向引物 3'-CGCTGAGGAAGTGGGAAAAG-5'。所有cDNA樣品分別配置qRT-PCR反應(yīng)體系。實驗操作過程按產(chǎn)品說明書進行：在反應(yīng)管內(nèi)依次加入 2×Super Real Pre Mix Plus（10 μl）、正向引物（10 μmol）（0.6 μl）、反向引物（10μmol）（0.6 μl）、cDNA（100 ng）、50×ROX Reference Dye △（0.4 μl），以RNase-Free ddH2O將反應(yīng)體系調(diào)至20 μl。將溶液混合后，短暫離心，將制備好的標準品和檢測樣本上機進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為95℃ 15 min；95℃10 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共 40個循環(huán)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，符合方差齊性及正態(tài)分布的采用單因素方差分析，不符合的進行Tamhane’s檢驗，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OVA激發(fā)后小鼠的行為表現(xiàn)

哮喘組以及布地奈德組小鼠激發(fā)后均出現(xiàn)不同程度的呼吸急促、喘息、煩躁不安、腹肌痙攣、搔鼻及站立不穩(wěn)等陽性行為，短時間內(nèi)可自行緩解。其中布地奈德組的哮喘癥狀較哮喘組癥狀明顯減輕。正常組未見明顯的異常表現(xiàn)。

2.2 各組小鼠肺組織病理改變

HE染色中正常組小鼠氣道黏膜未見明顯的炎癥細胞浸潤，氣管腔光滑，肺泡腔內(nèi)未見炎癥分泌物，無肺泡壁變薄。哮喘組小鼠氣道黏膜層可見明顯的炎癥細胞浸潤，以中性粒細胞、嗜酸性粒細胞增生為主，黏膜上皮細胞腫脹，肺泡腔內(nèi)可見炎癥細胞浸潤，肺泡壁變薄，氣道管腔變窄。經(jīng)布地奈德霧化吸入后，布地奈德組小鼠氣道黏膜可見炎癥細胞浸潤，黏膜上皮細胞仍有輕微的增厚，但與哮喘組小鼠相比明顯減輕，氣道管腔狹窄緩解（見圖1）。AB-PAS染色中正常組小鼠氣道上皮未見杯狀細胞，氣道平滑肌及基底膜未增厚，哮喘組小鼠氣道上皮可見明顯的杯狀細胞，氣道平滑肌及基底膜明顯增厚，經(jīng)布地奈德干預(yù)后，布地奈德組小鼠氣道上皮仍可見杯狀細胞，但比哮喘組相比明顯較少，氣道平滑肌增厚明顯減輕（見圖2）。

圖1 各組小鼠肺組織病理切片圖 （HE×400）

圖2 各組小鼠肺組織病理切片圖（AB-PAS×400）

2.3 各組小鼠肺組織病理學(xué)炎癥評分比較

各組小鼠肺組織病理學(xué)炎癥評分，正常組為（0.000±0.000），哮喘組為（3.625±0.518），布地奈德組為（1.750±0.463），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=105.903，P =0.000）；進一步兩兩比較顯示，與正常組比較，哮喘組小鼠肺組織炎癥評分增高（t=19.811，P=0.000）；與正常組比較，布地奈德組小鼠肺組織炎癥評分增高（t=10.693，P=0.000）；與哮喘組比較，布地奈德組小鼠肺組織炎癥評分降低（t=-6.355，P=0.000）。

2.4 各組小鼠BALF中IL-17細胞因子的表達比較

ELISA法檢測各組BALF中IL-17表達，正常組為（12.175±4.322）pg/ml，哮喘組為（58.750±10.026）pg/ml，布地奈德組為（29.522±8.900）pg/ml，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=67.020，P =0.000）；進一步兩兩比較顯示，與正常組比較，哮喘組中IL-17表達升高（t=12.496，P=0.000）；與正常組比較，布地奈德組小鼠中IL-17的表達升高（t=6.252，P=0.000）；與哮喘組比較，布地奈德組中IL-17的表達降低（t=-6.848，P=0.000）。

2.5 各組小鼠肺組織中IL-17 mRNA的表達比較

qRT-PCR目的基因的擴增曲線，見圖3。qRTPCR目的基因的熔解曲線，見圖4。

qRT-PCR檢測各組小鼠肺組織中IL-17 mRNA表達，正常組為（0.935±0.152）pg/ml，哮喘組為（6.898±1.559）pg/ml，布地奈德組為（3.613±0.681）pg/ml，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=73.390，P =0.000）；進一步兩兩比較顯示，與正常組比較，哮喘組中IL-17 mRNA表達升高（t=11.671，P=0.000）；與正常組比較，布地奈德組小鼠中IL-17 mRNA的表達升高（t=11.619，P=0.000）；與哮喘組比較，布地奈德組中IL-17 mRNA的表達降低（t=-5.372，P=0.000）。

圖3 目的基因的擴增曲線

圖4 目的基因的熔解曲線

3 討論

Th17細胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種新型的CD4+T細胞，一種獨立于Th1和Th2以外的輔助性T細胞。其特征性細胞因子為IL-17和IL-17F，IL-17F主要在黏膜防御反應(yīng)中起作用[8]。IL-17不僅可參與腫瘤、免疫性疾病，而且還與許多炎癥疾病有關(guān)。研究顯示[9]IL-17可以通過腫瘤壞死因子、IL-1的協(xié)同作用，放大炎癥效應(yīng)，進而參與哮喘等炎癥疾病的發(fā)生、發(fā)展。IL-17具有很強的募集中性粒細胞以及促進多種細胞釋放炎癥因子的作用[10]。哮喘是一種氣道慢性炎癥，有研究證明在哮喘患者肺組織、BALF、痰和血清中IL-17表達明顯增高[11-12]。但是IL-17在哮喘的肺組織中起抑制炎癥的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠BALF中IL-17的表達及肺組織中IL-17 mRNA表達較正常組均增高，并且哮喘組的氣道中嗜酸性粒細胞及中性粒細胞與正常組比較有所增多，杯狀細胞亦增多。進一步說明IL-17與哮喘的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的關(guān)系。

ICS是目前應(yīng)用最廣泛也是最有效的長期控制、預(yù)防哮喘發(fā)作的首選藥物，其治療哮喘的作用已成為國際共識[13]，其中布地奈德是ICS中最常用的一種，抗炎效果好，霧化吸入的布地奈德可以局部、直接作用于氣道黏膜[14]，局部抗炎作用強，可以有效地減少全身不良反應(yīng)，更好地控制哮喘患者的氣道炎癥及降低呼吸道阻力，進而緩解哮喘患者的呼吸困難、喘息等癥狀，以及縮短咳嗽持續(xù)的時間。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘組小鼠的BALF中IL-17表達及肺組織中IL-17 mRNA表達均升高，氣道中炎癥細胞及杯狀細胞增多，經(jīng)布地奈德干預(yù)治療后，降低哮喘小鼠肺中IL-17的表達，以及氣道中炎癥細胞減少。本研究提示IL-17在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中有一定的作用，而布地奈德的干預(yù)可以降低IL-17的表達，減少炎癥細胞在氣道中聚集，減輕哮喘小鼠肺部氣道炎癥。

綜上所述，致敏小鼠在反復(fù)的抗原激發(fā)后，哮喘組小鼠的氣道中炎癥細胞聚集，杯狀細胞增多，炎癥評分較正常組、布地奈德組均高，BALF中IL-17表達及肺組織中IL-17 mRNA表達均升高。而經(jīng)布地奈德干預(yù)后，與哮喘組比較，哮喘小鼠的氣道炎癥減輕，炎癥評分降低，BALF中IL-17表達及肺組織中IL-17 mRNA表達降低。本實驗結(jié)果表明，IL-17可以促進炎癥細胞在氣道中聚集，引起氣道炎癥，參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展，同時也表明布地奈德可抑制IL-17的合成、分泌，從而減輕氣道炎癥，進一步揭示抑制IL-17分泌是布地奈德控制哮喘的作用機制之一。