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    美托洛爾對(duì)急性心肌梗死大鼠心肌損傷及c-fos信號(hào)通路的影響

    2018-11-15 07:32:36徐燕
    關(guān)鍵詞:洛爾肝素心肌細(xì)胞

    徐燕

    (北京王府中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 心內(nèi)科,北京 100049)

    急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是冠狀動(dòng)脈突發(fā)持續(xù)缺血缺氧而造成的心肌壞死急癥,嚴(yán)重影響患者身心健康[1]。有關(guān)研究認(rèn)為[2],原癌基因c-fos與心血管疾病密切相關(guān),c-fos是細(xì)胞響應(yīng)外界刺激最先表達(dá)的基因,其編碼蛋白c-fos不能直接發(fā)揮作用,只有與c-Jun蛋白結(jié)合成激活蛋白轉(zhuǎn)錄因子1(activator protein transcription factor-1, AP-1),才能激活靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。突發(fā)心肌缺血時(shí),c-fos能即刻快速表達(dá),它在將刺激轉(zhuǎn)換為胞內(nèi)信號(hào)過程中發(fā)揮很重要的作用[3]。MAPK家族成員ERK1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2)是將胞外刺激信號(hào)傳遞到胞內(nèi)的共同通路,ERK1/2自我磷酸化后可通過磷酸化Elk-1(Ets-like protein-1),進(jìn)而誘導(dǎo)c-fos的轉(zhuǎn)錄[4]。美托洛爾是臨床常用選擇性β1-受體阻滯藥,其能降低心臟做功從而減少心肌需氧,在治療AMI時(shí),它能有效緩解胸痛,縮小梗死面積,延緩心力衰竭進(jìn)程,但目前關(guān)于美托洛爾治療AMI的具體作用機(jī)制尚不完全明確[5-6]。本研究通過復(fù)制AMI大鼠模型,在AMI大鼠服用美托洛爾后檢測(cè)ERK1、ERK2、c-fos的表達(dá)情況,探究美托洛爾減輕AMI大鼠心肌損傷的分子機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠150只,平均體重(328±20)g,購自北京維通利華公司。

    1.1.2 主要試劑和儀器 酒石酸美托洛爾(英國(guó)阿斯利康制藥公司,批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H32025390)。肝素鈉注射液(南京新百藥業(yè)有限公司,批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H32025851)。RNA提取試劑盒(美國(guó) Invitrogen公司)。buffer、dNTPs、RNase抑制劑、M-MLV[寶生物工程(大連)有限公司]。蛋白提取試劑(南京凱基生物公司)。c-Fos、ERK1/2、p-ERK1/2兔抗大鼠IgG溶液(一抗溶液)(美國(guó)Sigma公司)。堿磷酶標(biāo)記山羊抗兔IgG溶液(二抗溶液)(美國(guó)Sigma公司)。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)儀(美國(guó)Beckman Couhe公司),GIS-2020數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)(上海精密儀器儀表有限公司)。

    1.2 動(dòng)物模型復(fù)制

    本研究參考尹倪等[7]方法復(fù)制AMI模型。從150只大鼠中隨機(jī)取128只復(fù)制AMI模型,用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉,仰臥固定于手術(shù)臺(tái)后氣管插管,連接SAR-830小動(dòng)物呼吸機(jī)(美國(guó)CWE公司)輔助呼吸。于胸部4、5肋間開胸,在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳間下方1~2 mm處迅速結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支,縫合傷口,撤走呼吸機(jī)。12導(dǎo)聯(lián)同步記錄心電圖儀監(jiān)測(cè)大鼠心電圖示Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVR、aVL、aVF導(dǎo)聯(lián)ST段抬高≤0.5 mV,確定復(fù)制模型成功。為防止感染,術(shù)后3 d內(nèi)腹腔注射青霉素。剩余22只行假手術(shù),僅在左冠狀動(dòng)脈前降支穿線而不結(jié)扎,其他操作同上。

    1.3 分組與給藥處理

    128只大鼠中成功復(fù)制90只,死亡38只,將符合AMI模型的90只AMI大鼠隨機(jī)分為模型組、肝素組及美托洛爾組,每組各30只。另外22只行假手術(shù)的大鼠為假手術(shù)組。美托洛爾組在術(shù)后24 h直接灌胃給予0.1%美托洛爾生理鹽水10 mg/(kg·d),肝素組皮下注射給予肝素1 250 u/kg,模型組和假手術(shù)組直接灌胃給予等量生理鹽水,所有組均為10 ml/kg,1次/d。

    1.4 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)

    術(shù)后48 h和4周,將大鼠用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉,仰臥固定,采用高分辨率超聲儀檢測(cè)大鼠心率(heart rate, HR)、射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction, EF)、短軸縮短率(fractional shortening, FS)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension, LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension, LVIDs)各值,測(cè)量3次,求取平均值。

    1.5 心臟標(biāo)本的處理

    術(shù)后4周超聲檢測(cè)結(jié)束后處死大鼠,剖胸取出心臟,用于制作心臟標(biāo)本。每組大鼠的心臟標(biāo)本隨機(jī)分為兩部分:液氮凍存與灌注4%多聚甲醛固定,將心臟標(biāo)本沿左室長(zhǎng)軸垂直方向切成3份,取中間部分制作成Masson病理切片,然后用顯微鏡圖像處理系統(tǒng)掃描切片,依次量取左室截面外周長(zhǎng)、瘢痕弧長(zhǎng)與內(nèi)周長(zhǎng),心肌梗死面積(%)=2×瘢痕弧長(zhǎng)/(外周長(zhǎng)+內(nèi)周長(zhǎng))×100%。

    1.6 TUNEL法檢測(cè)心肌凋亡細(xì)胞

    每組剖胸取出心臟后,用PBS洗凈血液,浸沒于4%多聚甲醛中,過夜,用30%蔗糖使心臟脫水下沉,接著在冷凍下進(jìn)行切片,TUNEL染色后,用熒光顯微鏡觀察并拍照。

    1.7 qRT-PCR檢測(cè)c-fos、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)

    以GAPDH作為內(nèi)參基因,用NCBI Primer Blast設(shè)計(jì)定量引物序列(由上海生工生物工程股份有限公司合成),引物序列見表1。

    表1 引物序列

    每組4只液氮冷凍保存的心臟組織,利用Trizol法提取RNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性,并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度及濃度。取1.0μg總RNA,加入 Oligo(dT)1.0μl,加入13μl RNase-free H2O,混勻后,于85℃金屬浴中保溫5 min使RNA變性,然后放在冰上1 min以防RNA復(fù)性;然后繼續(xù)加入 4.0μl 5×buffer、2.0μl 10 mmol/L dNTPs、0.5μl RNase抑制劑、0.5μl M-MLV,混勻后30℃保溫10 min,42℃保溫1 h,85℃保溫10 min。合成cDNA第一鏈后,取5μl cDNA(稀釋20倍)為模板,加入10μl 2×SYBR Green qPCR Super Mix、0.5μlGAPDH(c-fos、ERK1或ERK2)正反向引物、4.0~20μl ddH2O,在qRT-PCR儀上擴(kuò)增。反應(yīng)條件:95℃ 30 s預(yù)變性,95℃ 5 s,60℃ 35 s,擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。采用 2-ΔΔCt法分析 qRT-PCR 結(jié)果,ΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)±s;ΔΔCt=(ΔCt目的基因-ΔCt內(nèi)參基因)±s。

    1.8 Western blot檢測(cè)

    每組取4只大鼠心臟組織,充分研磨后使用組織蛋白提取試劑提取蛋白質(zhì)。每組樣品取50μl,用Lowry法進(jìn)行蛋白定量,調(diào)節(jié)好蛋白濃度;將胞漿蛋白通過SDS-PAGE分離上清液,把分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上;將膜在1×TBS中浸泡10 min后,在5%牛血清蛋白溶液中封閉1 h,用1×TTBS洗滌2次,接著將膜分別置于在1︰100的c-Fos、ERK1/2、p-ERK1/2兔抗大鼠IgG溶液(一抗溶液)中,4℃孵育過夜;次晨將膜依次用1×TBS、1×TTBS快速清洗后,轉(zhuǎn)移到1︰1 000堿磷酶標(biāo)記山羊抗兔IgG溶液(二抗溶液)中在室溫下孵育2 h,依次用1×TTBS、1×TBS清洗后,用新配制的顯色液進(jìn)行顯色,待出現(xiàn)清晰的條帶后終止,最后使用GIS-2020數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)掃描并分析蛋白雜交條帶。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后,兩組間均數(shù)比較采用SNK-q檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 模型成功復(fù)制

    從150只大鼠中隨機(jī)取128只復(fù)制AMI模型,成功復(fù)制90只,死亡38只,且多在復(fù)制后24 h內(nèi)死亡;其余22只大鼠行假手術(shù),死亡2只。將復(fù)制成功的90只大鼠隨機(jī)分為模型組、肝素組和美托洛爾組,每組各30只。AMI大鼠行肉眼觀察及心電圖檢測(cè)發(fā)現(xiàn),結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支后,結(jié)扎處下方心肌顏色即刻變淺,局部心肌活動(dòng)變緩,心電圖各肢體導(dǎo)聯(lián)ST段抬高≤0.5 mV,為復(fù)制模型成功的表現(xiàn)。

    2.2 美托洛爾對(duì)AMI大鼠左心室功能的影響

    AMI術(shù)后48 h和4周,與假手術(shù)組、模型組比較,肝素組和美托洛爾組大鼠心率下降(P<0.05)。術(shù)后48 h,與假手術(shù)組比較,模型組、肝素組和美托洛爾組大鼠心臟EF、FS值均下降(P<0.05)。術(shù)后4周,與模型組比較,肝素組和美托洛爾組大鼠心臟EF、FS值均提高(P<0.05)。術(shù)后48 h,與假手術(shù)組比較,模型組、肝素組和美托洛爾組大鼠心臟LVIDd、LVIDs均增大(P<0.05)。術(shù)后4周,與模型組比較,肝素組和美托洛爾組大鼠心臟LVIDd、LVIDs均降低(P<0.05)。美托洛爾組超聲心動(dòng)圖各指標(biāo)與肝素組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。假手術(shù)組未出現(xiàn)心肌梗死,與模型組比較,肝素組和美托洛爾組大鼠心肌梗死面積減?。≒<0.05)。見表2。

    表2 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果(±s)

    表2 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果(±s)

    注:1)與假手術(shù)組比較,P <0.05;2)與模型組比較,P <0.05

    組別 HR/(次/min) EF/% FS/% LVIDd/mm LVIDs/mm 心肌梗死面積/%AMI術(shù)后48 h假手術(shù)組(n =20) 476.5±20.1 97.1±1.3 63.4±5.3 6.3±0.9 2.0±0.5 0模型組(n =30) 485.2±17.0 65.5±6.91) 31.2±3.11) 7.2±0.71) 4.8±0.71) 58.3±3.11)肝素組(n =30) 413.7±23.91)2) 65.1±8.21) 31.7±4.81) 7.4±1.11) 4.7±0.71) 57.5±4.61)美托洛爾組(n =30) 418.6±25.71)2) 64.9±7.31) 32.1±4.61) 7.3±0.91) 4.7±0.61) 57.1±4.31)F值 80.884 120.165 278.227 6.797 99.214 1 344.926 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 AMI術(shù)后4周假手術(shù)組(n =20) 491.3±36.5 97.9±1.2 61.8±7.3 6.4±0.8 2.0±0.6 0模型組(n =30) 481.5±25.3 66.1±4.31) 33.1±5.01) 7.1±0.91) 4.7±0.51) 47.1± 5.21)肝素組(n =30) 372.4± 35.61)2) 87.3±6.41)2) 54.2±4.51)2) 6.4±0.92) 3.6±0.81)2) 42.3±4.01)美托洛爾組(n =30) 363.9± 38.11)2) 85.9±6.01)2) 52.4±4.11)2) 6.5±1.12) 3.5±0.61)2) 41.2±4.11)F值 108.626 174.619 150.853 3.661 71.965 643.338 P值 0.000 0.000 0.000 0.015 0.000 0.000

    2.3 美托洛爾對(duì)AMI大鼠心肌損傷的影響

    用顯微鏡觀察Masson染色結(jié)果,紅色代表正常心肌細(xì)胞,藍(lán)色代表膠原纖維。術(shù)后4周,假手術(shù)組心肌細(xì)胞分布整齊,膠原增生不多。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌梗死邊緣的細(xì)胞雜亂分布,間質(zhì)中大量膠原增生,心肌纖維化水平升高。與模型組比較,肝素組和美托洛爾組藍(lán)色膠原減少,心肌纖維化水平降低。見圖1。

    2.4 美托洛爾對(duì)AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

    TUNEL結(jié)果顯示,AMI術(shù)后4周,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌梗死周邊細(xì)胞的凋亡率增加(P<0.05)。與模型組比較,肝素組和美托洛爾組大鼠心肌梗死周邊細(xì)胞的凋亡率降低(P<0.05)。見圖2。

    圖1 AMI大鼠4周后心肌細(xì)胞(Masson染色×200)

    圖2 美托洛爾對(duì)AMI大鼠4周后心肌細(xì)胞凋亡的影響

    2.5 美托洛爾對(duì)AMI大鼠心肌細(xì)胞c-fos、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)的影響

    qRT-PCR結(jié)果顯示,AMI術(shù)后4周,模型組大鼠心肌細(xì)胞c-fos、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)高于假手術(shù)組(P<0.05);肝素組、美托洛爾組大鼠心肌細(xì)胞c-fos、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)低于模型組(P<0.05)。見圖3。

    2.6 美托洛爾對(duì)AMI大鼠心肌細(xì)胞c-fos、ERK1/2及磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

    圖3 AMI大鼠4周后心肌細(xì)胞c-fos、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)

    Western blot結(jié)果顯示,AMI術(shù)后4周,ERK1/2蛋白表達(dá)各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組大鼠心肌細(xì)胞c-fos、p-ERK1/2蛋白表達(dá)高于假手術(shù)組(P<0.05)。肝素組、美托洛爾組大鼠心肌細(xì)胞 c-fos、p-ERK1/2 蛋白表達(dá)低于模型組(P<0.05)。見圖4。

    圖4 AMI大鼠4周后心肌細(xì)胞c-fos、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)

    3 討論

    AMI是一種很常見的心血管急癥,雖在西方國(guó)家最為常見,但其在中國(guó)發(fā)病率逐年上升。世界衛(wèi)生組織(WHO)預(yù)測(cè),到2020年AMI將成為全球第一大導(dǎo)致死亡原因[8]。臨床上常用β-受體阻滯劑治療AMI,其能拮抗兒茶酚胺與β-腎上腺素受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,從而阻斷興奮和激動(dòng)的傳遞[9-11]。美托洛爾作為一種選擇性β1-受體阻滯藥,在治療AMI時(shí)能降低心臟做功,減少心肌需氧,進(jìn)而減輕心肌損傷程度[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)AMI術(shù)后左心室相關(guān)指數(shù)發(fā)生一系列的變化,4周后Masson和TUNEL結(jié)果顯示:肝素、美托洛爾治療后心肌藍(lán)色膠原減少,心肌纖維化水平降低,且大鼠心肌梗死周邊細(xì)胞的凋亡率降低,說明美托洛爾可以緩解AMI大鼠的心肌損傷程度。

    c-fos是一種原癌基因,在細(xì)胞受到刺激后能即刻最先表達(dá),其編碼的核磷蛋白c-fos不能單獨(dú)起作用,只有與c-Jun蛋白結(jié)合成異源二聚體AP-1,才能活化目標(biāo)基因。c-fos基因在正常的心肌、血管內(nèi)皮和平滑肌中廣泛存在,參與細(xì)胞正常的生長(zhǎng)發(fā)育過程,在應(yīng)激反應(yīng)下有一定的組織保護(hù)作用,但其過度表達(dá)可導(dǎo)致AP-1下游基因腫瘤壞死因子的表達(dá),造成細(xì)胞凋亡過度[14-16]。研究發(fā)現(xiàn)[17],c-fos異常表達(dá)可能是動(dòng)脈粥樣硬化、心肌肥厚以及高血壓的病因之一。大量研究表明[18],在突發(fā)心肌缺血時(shí),c-fos表達(dá)上升,轉(zhuǎn)入核內(nèi)后與c-Jun結(jié)合成AP-1調(diào)節(jié)反向基因表達(dá),將外界信號(hào)轉(zhuǎn)換入胞內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞行為變化。c-fos啟動(dòng)子區(qū)主要有cAMP反應(yīng)組件(CRE)、血清反應(yīng)組件(SRE)與sis誘導(dǎo)組件(SIE),MAPK家族成員ERK1/2與細(xì)胞的增殖、分化密切相關(guān),是將胞外刺激信號(hào)傳遞到胞內(nèi)的共同通路,ERK1/2自我磷酸化后可通過磷酸化Elk-1,從而促進(jìn)三元復(fù)合物SRE/SRF/Elk-1的形成,進(jìn)而誘導(dǎo)c-fos的轉(zhuǎn)錄,其中SRF是血清反應(yīng)因子,因此ERK1/2的表達(dá)及磷酸化是c-fos表達(dá)的先決條件之一[19-21]。

    本研究首先復(fù)制AMI大鼠模型,超聲顯示AMI模型大鼠左心室指數(shù)發(fā)生顯著的變化,qRT-PCR結(jié)果顯示心肌組織中c-fos、ERK1、ERK2 mRNA的表達(dá)增加,這說明AMI后大鼠心臟的左心室出現(xiàn)了重塑現(xiàn)象。AMI大鼠服用肝素、美托洛爾后,與模型組相比,左心室心率降低,相關(guān)指數(shù)EF、FS、LVIDd、LVIDs發(fā)生變化程度較小,心肌組織中藍(lán)色膠原減少,心肌纖維化水平降低,細(xì)胞凋亡率下降,同時(shí)c-fos、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)較低,c-fos蛋白表達(dá)水平、ERK1/2的磷酸化水平同樣很低,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這說明肝素、美托洛爾可以降低c-fos、ERK1、ERK2的表達(dá)及ERK1/2的磷酸化,抑制信號(hào)在該通路上的傳遞。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明美托洛爾可減輕AMI大鼠后心肌損傷程度,其作用機(jī)制可能與p-ERK1/2-cfos相關(guān)途徑受到抑制有關(guān)。

    綜上所述,本研究通過結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支創(chuàng)建AMI模型,采用美托洛爾治療后,AMI大鼠的心肌損傷程度減輕,c-fos、ERK1、ERK2的表達(dá)水平及ERK1/2的磷酸化水平下降,暗示美托洛爾作用機(jī)制可能與p-ERK1/2-c-fos相關(guān)途徑受到抑制有關(guān)。然而AMI大鼠的心肌損傷發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)因素很多、相關(guān)機(jī)制復(fù)雜,美托洛爾緩解心肌損傷的作用機(jī)制還需繼續(xù)深入的探究。

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