印度塊菌-云南松菌根際土壤細(xì)菌的種群組成和群落結(jié)構(gòu)

鄧曉娟,閆興富,劉建利,劉培貴

1 北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,銀川 750021 2 中國科學(xué)院昆明植物研究所生物多樣性與生物地理學(xué)重點實驗室,昆明 650201

德國微生物學(xué)家Lorenz Hiltner于1904年首次提出了根際(rhizosphere)的概念,根系的表面以及受根系直接影響的土壤區(qū)域稱為根際,根際內(nèi)的微生物數(shù)量和種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于根際外的微生物數(shù)量和種類[1]。植物根系分泌的有機(jī)酸、碳水化合物等代謝產(chǎn)物,為微生物的生長和繁殖提供了有益條件,因此在植物的根際里定殖有很多生命活動旺盛的土壤微生物,使根際成為植物、土壤和微生物及其環(huán)境相互作用的中心,在植物和土壤之間構(gòu)成了一個活躍的物質(zhì)和能量交換界面[2]。根際里定殖的微生物稱為根際微生物,包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類和原生動物,根際微生物的種類和數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非根際微生物[3-4]。

大多數(shù)陸生植物的根系都會和菌根菌形成菌根,這種互惠共生關(guān)系在自然界中十分普遍[5]。植物的根和菌根菌在土壤中形成了一個完整統(tǒng)一的生態(tài)系統(tǒng),因此在原有根際概念的基礎(chǔ)上,菌根際(mycorrhizosphere)的概念就普遍使用,包括了菌根菌和菌根共生體[6]。菌根菌將其從共生植物處獲得的碳源轉(zhuǎn)化成海藻糖(trehalose),這種雙糖能夠選擇菌根根際中特定的細(xì)菌類群,在菌根菌和根際細(xì)菌相互作用的過程中扮演了很重要的角色[7-8]。同時,菌根改變了植物根的代謝功能,菌根菌的存在使菌根根際的微生物組成和根際的微生物組成具有很大的差別[9-10]。菌根對其周圍微生物群落進(jìn)行選擇和調(diào)節(jié),使其更有利于菌根本身的形成和發(fā)展[11]。真菌能否順利的侵染植物的根并形成菌根,不僅取決于其周圍的非生物因素,如土壤pH值、肥力、濕度和溫度,也取決于包括根際微生物在內(nèi)的生物因素[12]。

塊菌在商業(yè)貿(mào)易領(lǐng)域被稱為松露,是一種地下菌根真菌,因含有豐富的氨基酸和具有獨特的香味兒而享譽世界。塊菌在歐洲是一種奢侈頂級食材,被稱為“世界珍味之王”,同魚子醬、鵝肝醬并稱為法式三大美食。塊菌在市場上最為常見的種類有三種,包括產(chǎn)于歐洲的黑孢塊菌(Tubermelanosporum)和意大利白塊菌(T.magnatum),以及產(chǎn)于亞洲的印度塊菌(T.indicum)。印度塊菌主產(chǎn)于我國的云南、四川和西藏,每年以出口創(chuàng)匯為主,是我國西南地區(qū)農(nóng)民收入的重要來源。一方面,印度塊菌產(chǎn)區(qū)農(nóng)民在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下,在印度塊菌成熟前開始采挖,且采挖方式落后粗暴,導(dǎo)致自然塊菌資源迅速耗竭,生境受到嚴(yán)重的破壞,印度塊菌資源面臨著瀕危,部分商業(yè)化采集區(qū)域已瀕臨絕跡。另一方面,印度塊菌的純培養(yǎng)困難,加劇了印度塊菌自然資源所受到的壓力[13- 14]。為了緩解這種壓力,相關(guān)研究人員一直在嘗試人工合成塊菌菌根進(jìn)而實現(xiàn)人工栽培。中國科學(xué)院昆明植物研究所科研人員經(jīng)過十多年的努力,塊菌種植園已成功產(chǎn)出了印度塊菌子實體(http://www.cas.cn/ky/kyjz/201212/t20121220_3725060.shtml)。在塊菌菌根人工合成過程中,pH值、基質(zhì)配比等非生物因素的影響已經(jīng)有很多研究報道[15- 17],而微生物對于塊菌菌根形成的影響鮮有報道。在菌根際的細(xì)菌類群中,有些類群可以促進(jìn)菌根的形成,被稱之為菌根促生細(xì)菌(plant grow-promoting rhizobacteria, PGPR),研究根際細(xì)菌種群組成和群落結(jié)構(gòu)是探索塊菌菌根促生細(xì)菌的前提條件[18-21]。到目前為止,關(guān)于印度塊菌菌根際細(xì)菌的種群特征還未有報道。

在分子生物學(xué)技術(shù)被運用于環(huán)境微生物的研究之前,人們對微生物的認(rèn)識基本靠傳統(tǒng)的分離和純培養(yǎng)技術(shù)。盡管對于復(fù)雜環(huán)境中微生物的純培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)有了很大的發(fā)展和改進(jìn)[22],可培養(yǎng)的微生物還是不能很好的反映土壤微生物群落的多樣性。通過傳統(tǒng)分離方法可以獲得并進(jìn)行過研究的微生物種群數(shù)量只占自然界微生物總數(shù)的0.1%—1%[23]。高通量測序技術(shù)(high-throughput sequencing)又稱為“下一代”測序技術(shù),能以一次并行對幾萬條至幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定和一般讀長較短為標(biāo)志,能夠有效探測土壤微生物多樣性[24- 25]。本文通過傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法,以及高通量測序技術(shù),對印度塊菌-云南松菌根根際細(xì)菌的種群組成和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,對其根際細(xì)菌多樣性及優(yōu)勢類群進(jìn)行了探討。

1 研究材料和方法

1.1 樣品位置和采集

云南省楚雄市是印度塊菌主要的出產(chǎn)地,本研究選取云南省楚雄州姚安縣左門鄉(xiāng)后山的純云南松林為樣品采集地,面積約1000 m2,海拔2221—2330 m,土壤為偏堿性的石灰質(zhì)土壤(pH介于6—8范圍),含碳量22.12—89.22 g/kg,平均含鈣量17.3 g/kg。

在采樣地發(fā)現(xiàn)塊菌后,取出子囊果,編號后放入自封袋中保存。用一把鋒利且較長的小刀輕輕撥開塊菌子囊果下方的泥土,發(fā)現(xiàn)菌根后,以其為中心,取半徑1 cm以內(nèi)的所有土樣,放入15 mL離心管中保存,注明采集號,帶回實驗室處理。共采集到6份印度塊菌×云南松菌根際土壤,選取其中3份為本次實驗樣品。

1.2 塊菌菌根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的分離純化和鑒定

1.2.1 樣品的處理

稱取印度塊菌×云南松菌根際土壤樣品0.5 g,加入5 mL滅菌的生理液(NaCl 0.85%)稀釋成10-1菌液。同時制備10-2、10-3、10-4、10-5和10-6稀釋液,用以細(xì)菌的分離培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)菌的分離純化

分別在10-4、10-5和10-6的稀釋濃度下培養(yǎng)細(xì)菌, TSA培養(yǎng)基生化培養(yǎng)箱28℃條件下培養(yǎng)。每個濃度的平板設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.3 可培養(yǎng)細(xì)菌的鑒定和分析

對分離培養(yǎng)的單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),挑取菌落進(jìn)行鑒定。每份樣品挑取的菌落數(shù)繪制物種累積曲線,當(dāng)挑選的菌落數(shù)增加而種類不變時,不在增加挑選樣本的數(shù)量。對細(xì)菌的單菌落提取總DNA,擴(kuò)增16S rDNA(通用引物27f/1378r)序列(擴(kuò)增程序常規(guī))。將擴(kuò)增片段送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果通過NCBI上的Blast功能進(jìn)行比對,當(dāng)序列的相似度大于97%時被歸屬為同一個分類操作單元(OTU)。使用SeqMan(DNASTAR Package)對序列進(jìn)行編輯,采用Clustal 3 version 1.81[26]進(jìn)行多序列自動比對,并通過BioEdit Version 5.0.9[27]手動調(diào)整矩陣。系統(tǒng)發(fā)育分析采用Tamura[28]的方法。

1.3 菌根際土壤細(xì)菌基因組總DNA的提取和分析

1.3.1 基因組總DNA的提取

取0.5g左右的菌根際土壤,使用MP公司的FastDNA Spin Kit for Soil(116560- 200)試劑盒,按照其說明書完成對菌根際土壤微生物基因組總DNA提取。

1.3.2 16S rRNA V1—V3區(qū)擴(kuò)增和高通量測序

擴(kuò)增體系：5 μL 5×FastPfu緩沖液,2.5 μL 2.5×10-3mol/L dNTPs,1.0 μL 0.5×10-5mol/L 27F引物(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′),1.0 μL 0.5×10-5mol/L 533R引物(5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC- 3′),10 ng模板以及0.5 μL Fast Pfu Polymerase,最后加ddH2O到25 μL。獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司,利用羅氏454Titanium測序儀完成高通量測序序列分析。

1.3.3 測序數(shù)據(jù)分析

在《數(shù)據(jù)庫語言》課程中，第一堂課引入大數(shù)據(jù)應(yīng)用案例教學(xué)方法，可以引領(lǐng)學(xué)生緊跟大數(shù)據(jù)時代潮流，增進(jìn)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和信心。

在對序列進(jìn)行分析中,去除不含樣品信息的序列。過長序列末端的質(zhì)量會降低,在分析時去除序列尾部的低質(zhì)量序列。序列中含有模糊堿基(ambiguous)、單堿基高重復(fù)區(qū)(homologous)以及長度過短的序列,將這些序列納入分析會降低分析質(zhì)量,因此修剪、去除此部分序列,得到供精準(zhǔn)分析的優(yōu)化序列,并將序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分類操作單元(Operational Taxonomic Units, OTU)分析。生物信息分析中,測序得到的每一條序列來自一個菌。要了解一個樣品測序結(jié)果中的菌種、種屬等信息,需要對序列進(jìn)行歸類操作。通過歸類操作,將序列相似性達(dá)到97%歸為一個OTU,使用最大似然法聚類分析OTU。

2 研究結(jié)果和分析

2.1 菌根際可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性

在10-5和10-6的稀釋濃度下,細(xì)菌在TSA培養(yǎng)基能夠形成清晰獨立的菌落(圖1),選擇菌落數(shù)在20—200的培養(yǎng)皿,挑選細(xì)菌純化培養(yǎng),總計得到菌根際土壤細(xì)菌796株。

圖1 印度塊菌×云南松菌根際可培養(yǎng)細(xì)菌Fig.1 Culturable bacteria from Tuber indicum × Pinus yunnanensis mycorrhizosphere

圖2 可培養(yǎng)細(xì)菌菌落數(shù)量和OTUs之間的物種累積曲線 Fig.2 Species accumulation curves between OTUs and numbers of culturable bacterial clone in mycorrhizosphere

對可培養(yǎng)細(xì)菌菌落進(jìn)行測序分析,根據(jù)物種累積曲線(圖2),126株細(xì)菌被測序,其中76條序列(代表了61個OTUs)被用于本實驗分析。通過比對,在NCBI上下載39條序列,總計115條細(xì)菌16S rDNA序列用于此次分析。排序后得到了長度為1611 bp的序列矩陣,其中580個為信息位點(parsimony-informative),129個非信息位點(parsimony-informative)。啟發(fā)式搜索的最大簡約性分析產(chǎn)生了31棵同等簡約樹,步長為2035,一致性指數(shù)(CI)為0.650,留存指數(shù)(RI)為0.812。

基于根際可培養(yǎng)細(xì)菌16S rDNA序列構(gòu)建的最大簡約數(shù)表明(圖3),以2條大腸桿菌(Escherichiacoli)的16S rDNA序列為外類群(Clade 4),印度塊菌×云南松菌根際細(xì)菌的76條序列很好的聚在了3個Clades里。Clade 1包含了下載的27條隸屬于丙型變形菌門假單胞菌屬(Pseudomonas)序列,66條(代表了51個OTUs)本次實驗獲得的序列。Clade 2包含了下載的6條隸屬于乙型變形菌門不動細(xì)菌屬(Acinetobacter)序列,6條(代表了6個OTUs)本次實驗獲得的序列。Clade 3包含了下載的4條隸屬于放線菌門鏈霉菌屬(Streptomyces)序列,4條(代表了4個OTUs)本次實驗獲得的序列。

研究結(jié)果表明,印度塊菌×云南松菌根際可培養(yǎng)細(xì)菌分屬于3個屬的61個OTUs,其中假單胞菌屬(Pseudomonas)序列占83.6%,不動桿菌屬(Acinetobacter)序列占9.8%,鏈霉菌屬(Streptomyces)序列占6.6%。印度塊菌×云南松菌根際可培養(yǎng)細(xì)菌具有較低的多樣性,其中假單胞菌是其絕對優(yōu)勢類群。

圖3 基于根際細(xì)菌16S rDNA序列構(gòu)建的最大簡約樹中的一棵分支上的數(shù)字為≥50%的靴帶值Fig.3 One of most parsimonious trees based on the analysis of 16S rDNA sequences in mycorrhizosphere. Numbers above branches indicate bootstrap support above 50%

2.2 菌根際細(xì)菌高通量測序結(jié)果分析

圖4 菌根際土壤細(xì)菌可變區(qū)序列的數(shù)量和OTUs之間的Rarefaction曲線分析Fig.4 Rarefaction curve between OTUs and sequences of bacteria in mycorrhizosphere

提取印度塊菌×云南松菌根際土壤細(xì)菌總DNA,擴(kuò)增其16S rRNA V1-V3區(qū)并高通量測序,總計得到8937條序列2073個OTUs。根據(jù)對其測序數(shù)量和OTUs數(shù)量之間的關(guān)系進(jìn)行Rarefaction曲線分析(圖4),當(dāng)測序數(shù)量在8937條,相似度設(shè)為97%時,OTUs的數(shù)量還在增加,但曲線趨于緩和,測序數(shù)量可以滿足分析要求。

研究結(jié)果表明,印度塊菌-云南松菌根際土壤細(xì)菌類群具有較高的多樣性,物種種類豐富,優(yōu)勢菌群集中。變形菌門、放線菌門和酸桿菌門細(xì)菌是印度塊菌-云南松菌根際土壤細(xì)菌的優(yōu)勢類群,黃桿菌屬、根瘤菌屬和假黃色單胞菌屬細(xì)菌是印度塊菌-云南松菌根際土壤細(xì)菌。

3 討論

塊菌的代謝產(chǎn)物影響其周圍的土壤理化性質(zhì)以及共生植物根部微生物的類群,使得塊菌生長并形成子囊果的地方,大部分草本植物枯死,形成無草或少草的火燒區(qū)式的“菌塘”。菌塘土壤微生物種群和塊菌之間的關(guān)系緊密而復(fù)雜。土壤微生物通過影響真菌的生態(tài)適應(yīng)性,從而影響真菌的生長、分布及子囊果的形成和氣味成分的形成[29]。菌塘內(nèi)和菌塘外的土壤細(xì)菌類群的結(jié)構(gòu)不同,黑孢塊菌的菌塘內(nèi),隸屬于厚壁菌門、放線菌門和黃桿菌科的細(xì)菌為優(yōu)勢類群,其種類和數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于菌塘外土壤細(xì)菌的種類和數(shù)量[30]。

圖5 根際細(xì)菌OTUs在不同門的分布Fig.5 OTUs distribution in bacterial phylum

圖6 根際細(xì)菌OTUs在不同屬的分布Fig.6 OTUs distribution in bacterial genus

塊菌不僅影響菌塘內(nèi)的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu),同時也會影響菌根際細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。在過去十年,塊菌菌根合成的研究技術(shù)已經(jīng)取得了長遠(yuǎn)的進(jìn)步,獲得諸多組合式樣的菌根合成案例[15- 17]。隨著菌根技術(shù)的發(fā)展,人們越來越認(rèn)識到,除了非生物因素的影響,根際促生細(xì)菌(PGPR)對菌根的合成是否成功扮演著不可缺乏的角色[31]。隨著研究深入,在人工合成菌根的過程中,添加根際促生細(xì)菌成為一種現(xiàn)代且有效的生物技術(shù)手段[32]。盡管很多根際促生細(xì)菌的相關(guān)研究已經(jīng)報道,但塊菌菌根促生細(xì)菌的相關(guān)研究鮮有報道[32- 33],關(guān)于印度塊菌的菌根促生細(xì)菌研究還未見報道。本研究首次揭示了印度塊菌×云南松菌根際細(xì)菌的種群組成和結(jié)構(gòu)特征,為研究印度塊菌的菌根促棲菌奠定了基礎(chǔ)。

根據(jù)本次研究結(jié)果,印度塊菌×云南松菌根際可培養(yǎng)細(xì)菌以假單胞菌為絕對優(yōu)勢類群。假單胞菌為革蘭氏陰性細(xì)菌,能在植物根際土壤中大量增殖,許多菌株對植物有抑制病害、 促進(jìn)生長的作用,其中熒光假單胞菌(P.fluorescens)成為近幾十年來研究報道最多、最具應(yīng)用價值前景的一類生防菌[34]。假單胞菌也是沙漠塊菌(Terfeziaclaveryi)菌根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢類群,且其中孟氏假單胞菌(P.mandelii)明顯的提高了菌根的侵染率,被認(rèn)為是一種良好的菌根促生細(xì)菌被用于菌根合成生產(chǎn)中[35]。假單胞菌除在塊菌菌根際土壤里是優(yōu)勢類群,也是波氏塊菌(T.borchii)菌根根尖以及意大利白塊菌和沙漠塊菌(Te.boudieri)子囊果里的優(yōu)勢類群[36- 38]。假單胞菌是印度塊菌×云南松菌根際可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢類群,在印度塊菌的菌根促生細(xì)菌的研究時,假單胞菌為最理想的候選類群。

采用高通量測序技術(shù),擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V1—V3區(qū)進(jìn)行測序分析,印度塊菌×云南松菌根際土壤細(xì)菌類群具有很高的多樣性,其中變形菌門、放線菌門和酸桿菌門是其優(yōu)勢類群。同樣采用高通量測序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),夏塊菌(T.aestivum)的菌根際土壤細(xì)菌同樣是以放線菌門和變形菌門為優(yōu)勢類群[20]。放線菌門、變形菌門、擬桿菌門細(xì)菌也是黑孢塊菌菌根際土壤細(xì)菌的優(yōu)勢類群[39]。在黑孢塊菌的子囊果成熟過程中,菌根際微生物雖有動態(tài)變化,但都是以α-變形菌門和γ-變形菌門細(xì)菌為優(yōu)勢類群[40]。以上研究所取土壤類型、塊菌和共生宿主植物都不一致,但菌根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢類群具有相似性,變形菌門和放線菌門細(xì)菌為菌根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢類群。本研究結(jié)果為印度塊菌的菌根合成、種植園精細(xì)管理以及根際土壤微生物功能的研究奠定了基礎(chǔ),明確了方向。

當(dāng)研究菌根際土壤微生物多樣性時,相比新一代的高通量測序的方法,傳統(tǒng)平板培養(yǎng)的方法會錯過很多類群和重要信息。但是,對于根際細(xì)菌的功能研究,以及細(xì)菌對菌根真菌的促生作用的研究,都離不開對細(xì)菌的傳統(tǒng)平板培養(yǎng)方法。因此,本實驗不僅采用高通量測序的方法,全面揭示了印度塊菌菌根際土壤微生物的種群組成,同時采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)的方法,對其可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了分離并鑒定,為菌根際細(xì)菌的功能研究,以及菌根促生菌的篩選提供重要數(shù)據(jù)。

致謝：中國科學(xué)院昆明植物研究所劉培貴研究員給予支持,山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院喬鵬博士幫助樣品采集,特此致謝。