溫度對豚鼠心肌細(xì)胞快激活延遲整流鉀電流的調(diào)節(jié)

王小艷，吳婷婷，龐斯斯，王 森

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210029)

快激活延遲整流鉀電流(Ikr)是心肌細(xì)胞復(fù)極化的主要電流，抑制Ikr可使動作電位時程延長，引起早后除極，致心律失常的發(fā)生。編碼人類心肌細(xì)胞Ikrα亞單位的基因?yàn)閔ERG(human ether-a-go-go-related gene, 或KCNH2)[1]。該基因突變可導(dǎo)致遺傳性長QT綜合征- 2 LQTS- 2，而許多抗心律失常藥物及非抗心律失常藥物對hERG通道的過度抑制是獲得性長QT綜合征的主要發(fā)病機(jī)制[2- 3]。將hERG基因轉(zhuǎn)染至中國倉鼠卵母細(xì)胞(CHO)上發(fā)現(xiàn)hERG電流及其門控特性受溫度的影響較大[4]。本實(shí)驗(yàn)觀察在不同實(shí)驗(yàn)溫度下心肌細(xì)胞Ikr電流的大小以及門控特性，為進(jìn)一步研究心肌細(xì)胞Ikr提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級雄性豚鼠[南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證號：SYXK(蘇)2013-0015]，體質(zhì)量250～350 g。

1.1.2 溶液：含鈣臺式液成分(mmol/L, pH 7.4): NaCl 143、 KCl 5.4、 NaH2PO40.25、HEPES 5.0、 MgCl20.5、CaCl21.8和D-glucose 5.6; 無鈣臺式液為含鈣臺式液中不加CaCl2。電極內(nèi)液(mmol/L, PH 7.4): KCl 140、 CaCl21、 MgCl22、 HEPES 10、 EGTA 11、 Na2-ATP 5和creatine phosphate(disodium salt) 5; 電極外液(mmol/L,PH 7.4) NaCl 140、 KCl 3.5、 CaCl21.5、 MgSO41.4、 HEPES 10, 另外加入10 μmol/L nifedipine阻斷L型鈣電流以及10 μmol/L chromanol 293B阻斷慢激活延遲整流鉀電流。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠心室肌細(xì)胞分離：采用酶解法制備心室肌單細(xì)胞。取豚鼠心臟,置4 ℃臺式液中，心臟稍加修飾后連于Langendorff灌流裝置上，經(jīng)主動脈逆向灌流，灌流速度為7 mL/min，先以含鈣臺式液灌流2 min，繼以無鈣臺式液灌流5 min，心臟逐漸停止跳動，予含II型膠原酶0.4 mg/mL和牛血清白蛋白1 mg/mL的無鈣臺式液消化10～15 min，剪下左心室置于KB液中，將左心室組織剪成小碎塊，輕輕吹打3～5 min，以200目尼龍網(wǎng)過濾，500 r/min離心后棄上清液，加入新的KB液。室溫保存2 h后選擇邊緣整齊、表面無顆粒、橫紋清晰、無收縮的細(xì)胞用于全細(xì)胞膜片鉗的記錄。整個灌流過程中持續(xù)通氧，灌流液溫度保持在37 ℃左右。

1.2.2 離子通道電流的記錄：應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗記錄快激活延遲整流鉀電流。膜片鉗放大器(HEKA，EPC9,Germany)同計(jì)算機(jī)連接。刺激信號及電壓輸入信號的采集均由軟件(Pulse, Pulse-Fit V8.53)控制。膜片鉗參數(shù)為：鉗制電壓-40 mv，預(yù)刺激從-40 mv至+40 mv，脈寬200 ms，刺激從相應(yīng)電壓降至-40 mv，脈寬600 ms，記錄外向尾電流。

2 結(jié)果

2.1 快激活延遲整流鉀電流(Ikr)記錄及驗(yàn)證:常溫下記錄到的Ikr尾電流，Ikr特異性阻斷劑多非利特dofetilide(1 μmol/L)可完全阻斷該電流，證明該部分電流即為純的Ikr尾電流(圖1)。

2.2 溫度對Ikr尾電流的影響:Ikr尾電流對溫度極為敏感，在溫度為22 ℃～37 ℃，Ikr尾電流隨著溫度的升高(22 ℃, 27 ℃, 32 ℃, 37 ℃)而增大(圖2A)。當(dāng)預(yù)刺激電壓為+40 mV時，Ikr電流密度由22 ℃時的(0.27±0.15)pA/pC增加到37 ℃時的(0.62±0.15)pA/pC(P<0.01)(圖2B)。半數(shù)最大激活電壓(V0.5)從22 ℃時的(-3.59±4.20)mV變?yōu)?7 ℃時的(-4.45±3.53)mV(圖2C)，slope factor(k)從17.38±3.98變?yōu)?0.19±3.15(P<0.01)(圖2D)。

Recording of Ikr tail current in the same cell before(A) and after (B) superfusion with dofetilide at room temperature

A.representative Ikr tail current traces recorded at different temperature； B.the current density induced by depolarizing voltage clamp pulse +40 mV at 22 ℃ and 37 ℃； C.the half-maximal activation voltage(V0.5) of the myocytes measured under 22 ℃ and 37 ℃; D.the slope factor (k) of the myocytes measured under 22 ℃ and 37 ℃； *P<0.01 compared with 22 ℃

3 討論

Ikr鉀通道對于正常心臟的電生理活動是必需的，它介導(dǎo)了動作電位3期的復(fù)極化，且它是唯一可在每一次動作電位末尾時調(diào)控細(xì)胞膜復(fù)極的電流，對心率的調(diào)節(jié)及維持細(xì)胞的興奮性起重要作用。目前國內(nèi)外鮮有關(guān)于溫度對Ikr電流的調(diào)控的研究，將hERG基因轉(zhuǎn)染到中國倉鼠卵母細(xì)胞上，研究溫度對HERG電流的影響，發(fā)現(xiàn)溫度升高后，herg的激活曲線向超極化的方向移動，而失活曲線向去極化的方向移動[4]。然而，雖然轉(zhuǎn)染細(xì)胞在研究通道、分子機(jī)制方面有強(qiáng)大的優(yōu)勢，然而鉀通道還存在調(diào)節(jié)亞單位(β亞單位)如minK,miRP1、激酶結(jié)合蛋白、細(xì)胞支架成分以及其他的一些蛋白，這些物質(zhì)在轉(zhuǎn)染細(xì)胞與心肌細(xì)胞中有很大的不同，因此，直接對心肌細(xì)胞進(jìn)行研究快激活延遲整流鉀電流很有必要的。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ikr電流受溫度的影響較大，隨著溫度的升高，Ikr電流明顯增加，同時半數(shù)最大激活電壓(V0.5)和slope factor(k)均隨溫度升高而更小，電壓激活曲線向更負(fù)的方向移動。提示當(dāng)細(xì)胞所處環(huán)境的溫度從22 ℃升至37 ℃，細(xì)胞內(nèi)的Ikr離子通道更加易于開放，且開放的數(shù)量明顯增加，從而介導(dǎo)Ikr電流明顯增加。因此，一定范圍內(nèi)的溫度變化可以調(diào)節(jié)單個心肌細(xì)胞表面離子通道的啟閉，影響離子通道的電學(xué)特點(diǎn)，介導(dǎo)離子流大小的改變，從而影響整體心肌的電活動和動作電位，甚至整體心臟的電生理特征。

有報(bào)道，在記錄離子流時所采用的溫度不盡相同，有在室溫下，也有在生理溫度下進(jìn)行。本研究提示，在記錄Ikr電流時，實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度影響電流強(qiáng)度。深入了解溫度對離子通道的影響及機(jī)制，可更深入了解心肌細(xì)胞的電學(xué)特性。