長鏈非編碼RNA GASL1在乳腺癌組織及細胞系中的表達及作用

吳多明，武 力，張曉斌，馬大昌

(蘭州大學第一醫(yī)院 乳腺病科， 甘肅 蘭州 730000)

乳腺癌是嚴重影響女性健康最常見的惡性腫瘤。分子生物學快速發(fā)展促使乳腺癌的基因治療成為研究的熱點[1]。探尋與乳腺癌相關的抑癌基因和促癌基因為乳腺癌的診治提供了新的研究方向[ 2]。

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，lncRNA)是一類轉錄本長度超過 200 nt非編碼RNA。研究表明，lncRNA參與包括乳腺癌在內的多種癌的發(fā)生發(fā)展[3]。與乳腺癌發(fā)病、預后和耐藥等密切相關的lncRNA不斷被發(fā)現(xiàn)。新近研究發(fā)現(xiàn)了一個新的lncRNA，命名為GASL1(growth-arrest associated lncRNA 1)[4]。GASL1可調節(jié)人骨肉瘤細胞U2OS的細胞周期，參與細胞增殖和集落形成。且肝癌患者癌組織中GASL1的表達水平與患者的生存周期呈正相關，上述研究表明GASL1可能是一個新的與癌密切相關的lncRNA。本研究旨在研究GASL1與乳腺癌的關系，將開展工作如下：1)GASL1在乳腺癌患者癌組織與癌旁正常組織中的表達差異；2)GASL1對乳腺癌細胞的增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和試劑：正常的人乳腺細胞系 HBL- 100和人乳腺癌細胞系MDA-MB- 231、MDA-MB- 468、MCF- 7 和 SK-BR- 3(ATCC細胞庫)。培基和胎牛血清(BI 公司)。Trizol、RNA 提取試劑盒和反轉錄試劑(寶生物工程有限公司)。LncRNA GASL1和GAPDH引物、si-GASL1、si-NC、pcDNA3.1、pcDNA3.1-GASL1和 LipofectamineTM2000(廣州銳博生物科技有限公司)。MTT、caspase- 3 活性檢測試劑盒(碧云天生物技術公司)。Bax一抗、Bcl- 2一抗和羊抗鼠二抗(Abcam公司)。

1.1.2 樣本收集：隨機選取2015-2016 年在蘭州大學第一醫(yī)院進行乳腺癌切除手術的 30 例乳腺癌患者，所有患者均已經過病理學確診，簽署知情同意書，并由蘭州大學第一醫(yī)院倫理委員會批準。切除術后摘取微量乳腺癌組織(cancer tissues)及癌旁乳腺組織(paracancerous tissue)用于本研究，癌旁組織距離癌組織距離在1 cm左右，凍于-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：用10%胎牛血清高糖DMEM培基培養(yǎng)乳腺癌細胞系(MDA-MB- 231、MDA-MB- 468和SK-BR- 3)及正常乳腺細胞HBL- 100，用10%胎牛血清 RPML1640 培基培養(yǎng)MCF- 7細胞，在 37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細胞轉染：設計合成3個lncRNA GASL1 siRNA片段和GASL1過表達質粒pcDNA3.1-GASL1。培養(yǎng)瓶中細胞消化后接種于培養(yǎng)板，待細胞匯合至60%左右時，利用LipofectamineTM2000轉染lncRNA GASL siRNA或pcDNA3.1-GASL1至細胞內。RT-qPCR檢測其轉染效率。

1.2.3 細胞增殖、caspase- 3活力和凋亡相關蛋白的檢測：用MTT法檢測細胞轉染后0、12、24和48 h時的細胞活力(即細胞增殖)，用caspase- 3活性檢測試劑盒檢測caspase- 3，Western blot檢測Bcl- 2和Bax的蛋白表達水平。具體操作參照試劑說明書進行。

1.2.4 RT-qPCR檢測lncRNA GASL1表達：Trizol法提取總RNA，反轉錄得到cDNA。在cDNA中加入PCR熒光試劑和引物于ABI- 7300 PCR儀進行擴增和檢測。ABI- 7300系統(tǒng)分析得到lncRNA GASL表達量。引物序列如下： GASL1上游引物5′-CTGA GGCCAAAGTTTCCAAC-3′，GASL1下游引物5′-CAG CCTGACTTTCCCTCTTCT-3′；GAPDH上游引物5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，GAPDH下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.2.5 Western blot 檢測蛋白表達:收集細胞，加入蛋白裂解液(WIP 裂解液∶PMSF=100∶1)，裂解1 h后離心，吸取上清，加入上樣緩沖液變性(99 ℃，7 min)，運用 BCA 蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。具體操作參照試劑說明書進行。

制備 10%的分離膠和濃縮膠，根據(jù)上述測定的蛋白濃度計算上樣體積(20 μg 總蛋白)，控制電壓和時間(80 V，30 min；120 V，1 h)進行電泳，濕轉法轉膜，PVDF 膜孵育一抗(Bax和 Bcl- 2，均1∶1 000)4 ℃過夜，TBST漂洗，加入二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗，置于自動顯影儀(ChemiDocXRS 成像系統(tǒng))顯影。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 乳腺癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA GASL1表達水平降低

30例乳腺癌患者的癌組織和癌旁正常組織均經雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)免疫組化驗證(圖1A)，且發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中l(wèi)ncRNA GASL1表達水平相對癌旁正常組織降低(圖1B，P<0.05)。

2.2 乳腺癌細胞系中l(wèi)ncRNA GASL1的表達水平降低

相比人正常乳腺細胞HBL- 100，乳腺癌細胞MCF- 7、MDA-MB- 468、MDA-MB- 231和SK-BR- 3中l(wèi)ncRNA GASL1的均表達降低(P<0.05)，且MCF- 7表達水平降低最顯著(圖2)，故選用MCF- 7用于后續(xù)實驗。

2.3 過表達lncRNA GASL1可抑制MCF- 7的增殖，促進其凋亡

相比空白質粒(pcDNA3.1)，pcDNA3.1-GASL1能有效的過表達lncRNA GASL1(圖3A)。MCF- 7細胞經pcDNA3.1-GASL1過表達GASL1可抑制MCF- 7細胞增殖，且呈時間依賴性(圖3B)。caspase- 3活力、 Bcl- 2和Bax水平是反映細胞凋亡的重要指標。過表達lncRNA GASL1可增強caspase- 3活力、減少Bcl- 2表達和增加Bax表達(圖3C～E)，即過表達lncRNA GASL1可促進MCF- 7細胞凋亡。上述一系列實驗結果表明，過表達lncRNA GASL1可抑制MCF- 7的增殖，促進其凋亡。

A.ER and PR immunohistochemical analysis(×200); B.lncRNA GASL1 expression was down-regulated in breast cancer tissue; *P<0.05 compared with paracancerous tissues

*P<0.05 compared with HBL- 100

2.4 干擾lncRNA GASL1表達可促進MCF- 7增殖，抑制其凋亡

相比無關序列NC片段，3個siRNA片段均能有效的干擾lncRNA GASL1的表達，其中片段1的干擾作用最強(圖4A)，用于后續(xù)細胞功能研究。MCF- 7細胞經siRNA片段1干擾lncRNA GASL1表達可促進MCF- 7細胞增殖，且呈時間依賴性(圖4B)。此外，lncRNA GASL1 siRNA可降低細胞caspase- 3活力、增加Bcl- 2表達和減少Bax表達(圖4C～E)， 即干擾lncRNA GASL1表達可抑制MCF- 7細胞凋亡。上述一系列實驗結果表明，干擾lncRNA GASL1表達可促進MCF- 7的增殖，抑制其凋亡。

A.transfection with pcDNA3.1-GASL1 significantly up-regulated the expression of lncRNA GASL1; B.transfection with pcDNA3.1-GASL1inhibited the proliferation of MCF- 7; C.transfection with pcDNA3.1-GASL1 increased the activity of caspase- 3; D, E.transfection with pcDNA3.1-GASL1 down-regulated the expression of Bcl- 2 and up-regulated the expression of Bax; pcDNA3.1.empty plasmid; *P<0.05 compared with pcDNA3.1

A.transfection with 3 si-GASL1 segments significantly down-regulated the expression of lncRNA GASL1; B.transfection with si-GASL1 promoted the proliferation of MCF- 7; C.transfection with si-GASL1 decreased the activity of caspase- 3; D, E.transfection with si-GASL1 up-regulated the expression of Bcl- 2 and down-regulated the expression of Bax.si-NC: negative control sequence; *P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with si-NC

3 討論

人類基因組中70%～90%的基因序列可轉錄為RNA， 僅有2% 的 RNA具有編碼蛋白質的功能，這些不具有編碼蛋白質功能的RNA稱為非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，根據(jù)長度又可分為短鏈ncRNA(≤200 nt)和長鏈ncRNA(>200 nt)[5]。長鏈ncRNA(lncRNA)作為原癌基因或抑癌基因在乳腺癌中廣泛存在，且與乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關[6]。

lncRNA HOTAIR 的異常表達是乳腺癌的獨立預后因素[7]，HOTAIR 在原發(fā)性乳腺癌中的表達量是正常乳腺上皮的 125 倍，在轉移性乳腺癌中超過正常乳腺上皮的2 000倍[8]，且 HOTAIR 的過表達與患者遠處轉移及不良預后相關。研究發(fā)現(xiàn)，將乳腺癌細胞的 MALAT1 基因敲除后，不僅腫瘤細胞的增殖過程被抑制、其侵襲性和轉移力也明顯下降[9]。另有研究報道，lncRNA除了參與乳腺癌疾病的發(fā)生發(fā)展還參與乳腺癌耐藥性的調節(jié)。乳腺癌患者接受他莫昔芬治療后，高表達 BCAR4 患者的無進展生存期(PFS)和 總生存期(OS)都較低表達的患者短[10]。在他莫昔芬敏感細胞系ZR- 75- 1 中過表達BCAR4 能顯著降低他莫昔芬抑制腫瘤細胞的增殖能力，說明BCAR4 可能與乳腺癌對他莫昔芬耐藥相關。

新近研究發(fā)現(xiàn)了一個新的lncRNA-GASL1[4]，進一步研究發(fā)現(xiàn)：1) GASL1參與調控細胞周期，可促進細胞由G1向S期轉化；2)運用siRNA干擾人骨肉瘤細胞U2OS中GASL1表達可促進細胞增殖和集落形成；3)運用敲除GASL1的U2OS細胞和野生型U2OS建立異種移植建立的荷瘤小鼠模型，GASL1敲除的U2OS小鼠癌組織生長速率比野生型U2OS更快；4)肝癌患者肝癌組織中GASL1的表達水平與患者的生存周期呈正相關。上述一系列研究表明，GASL1可能是又一個新的參與癌癥發(fā)生發(fā)展的lncRNA。本研究發(fā)現(xiàn)， GASL1乳腺癌患者癌組織和乳腺癌細胞系中表達減少，提示GASL1可能參與調節(jié)乳腺癌功能。進一研究發(fā)現(xiàn)，過表達GASL1可抑制MCF- 7的增殖，促進其凋亡；干擾GASL1表達可促進MCF- 7的增殖，抑制其凋亡。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)lncRNA GASL1在乳腺癌組織和乳腺癌細胞中表達降低，通過調節(jié)乳腺癌細胞增殖和凋亡參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。GASL1可能是防治乳腺癌的新靶點和診斷乳腺癌的新型生物標志物。GASL1調節(jié)乳腺癌細胞增殖和凋亡的具體機制和是否參與乳腺癌耐藥尚不清楚，這將是我們下一步研究的重點。