甘露醇不同時間給藥聯(lián)合醒腦靜對實驗性腦出血大鼠灶周水腫的影響

張 運， 王莉莉， 唐 濤， 賀茂林

滲透性脫水藥甘露醇具有降低顱內(nèi)壓、減輕腦水腫、預防腦疝形成的作用，被廣泛應用于腦出血急性期治療。也有研究顯示甘露醇對腦出血患者預后的改善作用有限[1]。有研究報道，醒腦靜聯(lián)合甘露醇治療腦出血有一定的臨床療效，可減少血腫量，改善患者神經(jīng)功能[2]。但是，關(guān)于甘露醇介入最佳時間點尚存在爭議。本實驗通過建立大鼠的腦出血模型，研究甘露醇不同時間給藥聯(lián)合醒腦靜對實驗性腦出血大鼠，腦出血后神經(jīng)功能恢復、腦水腫及血清炎性因子水平IL-1β、TNF-α的影響，以探討甘露醇聯(lián)合醒腦靜治療腦出血的最佳介入時間，從而為腦出血的臨床治療提供有利的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑：醒腦靜注射液10 ml/支，無錫山禾藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：國藥準宇Z32020563。醒腦靜注射液由無錫濟民可信山禾藥業(yè)股份有限公司提供。兔抗TNF-α多克隆一抗、兔抗 IL-1β多克隆一抗由武漢博士德生物技術(shù)有限公司提供。甘露醇：由湖南科倫制藥有限公司生產(chǎn)。SABC、DAB試劑盒等由武漢博士德生物試劑公司提供。實驗動物：健康雄性SD大鼠126只，體重230～300 g(由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供)。實驗動物隨機分為兩組，即假手術(shù)組； 腦出血組(出血量為50 μl，按出血后醒腦靜與甘露醇給藥時間又分為對照組、醒腦靜組、甘露醇6 h組、甘露醇6 h+醒腦靜組、甘露醇24 h組、甘露醇24 h+醒腦靜組、甘露醇48 h組、甘露醇48 h+醒腦靜組,共8個亞組),每小組14只,若實驗過程中大鼠死亡,則繼續(xù)造模補充，保證每個亞組14只大鼠。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠腦出血模型制作 大鼠術(shù)前8 h禁食，不禁水。參照Del Bigio等的報道方法制備大鼠ICH模型[3]。大鼠稱重后以10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉后俯臥位固定于立體定向儀上。頭部正中皮膚切一長約0.8 cm的縱切口,暴露前囟,調(diào)整立體定向儀，使其上的微量注射儀套管尖端定位于前囟前0.2 mm，左側(cè)中線旁開3 mm鉆一小孔,穿透顱骨但不傷及腦組織,剪尾取血,用微量注射儀吸取新鮮血液約50 μl插入已鉆好的孔內(nèi)，向內(nèi)進針 6 mm(相當于尾狀核部位)。在 2.0 min內(nèi)注入50 μl自體不凝血。留針5 min后緩慢退針。假手術(shù)對照組注入同體積的生理鹽水。

1.2.2 實驗陽性大鼠選擇 實驗陽性大鼠選擇參照Longa FZ等的評分法[4]：0分，無體征；1分，不能完全伸展進針對側(cè)肢體(左側(cè))；2分，進針對側(cè)肢體癱瘓，向進針對側(cè)轉(zhuǎn)圈，有追尾現(xiàn)象；3分，不能站立向進針對側(cè)傾倒；4分，有意識障礙。神經(jīng)功能缺陷評分≥2分，及大鼠腦切片中有明顯的圓形、橢圓形或不規(guī)則的血腫存在為模型成功標準，血液針道反流、進入腦室或死亡者均剔除。按要求模型制作成功112只。

1.2.3 藥物干預 醒腦靜：腹腔注射醒腦靜注射液1 0 ml/kg，每日一次；模型組、假手術(shù)組和正常組均腹腔注射與醒腦靜等容量蒸餾水，每日一次[5]。甘露醇組于大鼠術(shù)后6 h、24 h、48 h，尾靜脈注射甘露醇1.0 g/kg。每6 h 一次。

1.2.4 觀察指標及檢測方法 神經(jīng)功能缺損評分：選擇參照Longa FZ等的方法[4]： 每組大鼠，分別于術(shù)前、術(shù)后24 h、72 h、1 w觀察大鼠行為學變化。標本及病理切片的制作：在相應時間點完成神經(jīng)功能缺損評分后，從每組大鼠中隨機挑取大鼠用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉，迅速打開胸腔， 由左心室灌注生理鹽水。直至由剪開的右心耳流出的液體變?yōu)榍辶翞橹?，然后斷頭取腦，腦組織標本浸于10%福爾馬林液中固定72 h，沿注射針孔冠狀面將鼠腦切開成兩部分，分別做腦含水量測定及免疫組織化學染色。免疫組織化學染色制片方法：貼近針眼取厚約5 mm的冠狀切片,石蠟包埋,最后在切片機上連續(xù)切片。腦組織含水量測定：取4.2中所取腦組織貼近注射針眼處去約100 mg血腫周圍腦組織，用電子天平先稱取濕重(WW，精確到1 mg)后，電熱恒溫培養(yǎng)干燥箱100 ℃烘烤48 h，再稱取干重(DW，精確到1 mg)。按Elliott公式計算腦組織含水量：腦組織含水量(%)=(WW-DW)，WW×100%。免疫組化：取上述包埋好的石蠟4 μm連續(xù)切片作IL-1β、TNF-α細胞免疫組化染色。按免疫組化SP法試劑盒說明書操作。陰性對照用PBS 代替一抗。在光鏡下進行觀察，細胞質(zhì)或細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細胞。采用Image ProPlus 6.0全自動圖像分析系統(tǒng)，分別測每高倍鏡(10×40倍)視野內(nèi)的IL-1β、TNF-α吸光度，每只大鼠選擇3張腦組織片，每張切片選3～5個視野，計算各組的平均光密度值OD。

2 結(jié) 果

2.1 各組不同時間神經(jīng)功能缺損評分的比較 造模前對各組模型鼠的神經(jīng)功能缺損進行評分，結(jié)果全部為0分。造模后24 h,各腦出血模型組神經(jīng)功能缺損評分均顯著高于假手術(shù)對照組(P<0.01)。其中，醒腦靜組評分低于模型對照組(P<0.05)。而單獨應用甘露醇的6 h組與模型對照組比較未見明顯差異(P>0.05)。甘露醇24 h+醒腦靜組評分顯著低于模型對照組(P<0.01)，也低于甘露醇24 h組(P<0.05)。造模后1 w,除醒腦靜組以外各組實驗鼠神經(jīng)功能缺損評分均較24 h有所減低(P<0.05)。其中，甘露醇24 h+醒腦靜組評分顯著低于模型對照組(P<0.01)，也低于甘露醇24 h組(P<0.05)。甘露醇48 h+醒腦靜組評分低于模型對照組(P<0.05)(見表1)。

2.2 大鼠腦組織水含量的變化 甘露醇24 h+醒腦靜組與甘露醇48 h+醒腦靜組在72 h與1 w時的腦組織水含量均顯著低于同時間點模型對照組(P<0.05)。將此兩組進行比較，甘露醇24 h+醒腦靜組在72 h時的腦組織水含量低于甘露醇48 h+醒腦靜組，比較差異有顯著性意義(P<0.05)。提示在造模后1 w內(nèi)，僅醒腦靜聯(lián)合24 h或48 h給與甘露醇干預對腦出血模型鼠腦組織水腫起到減輕作用，其中醒腦靜聯(lián)合24 h給與甘露醇干預作用更明顯(見表2)。

2.3 各組IL-1β、TNF-α平均積分光密度值表達的比較

2.3.1 IL-1β造模后24 h，各腦出血模型組IL-1β平均積分光密度值均顯著高于造模前(P<0.01)。其中，醒腦靜組與甘露醇6 h+醒腦靜組IL-1β平均積分光密度值均低于模型對照組(P<0.01)。而單獨應用甘露醇的6 h組IL-1β平均積分光密度值與模型對照組比較未見明顯差異(P>0.05)。造模后72 h與1 w時,各組實驗鼠IL-1β平均積分光密度值均較24 h顯著降低(P<0.01),且均顯著低于模型對照組(P<0.01)。此外，在72 h及1 w時，3組醒腦靜聯(lián)合甘露醇實驗鼠IL-1β平均積分光密度值均低于同時間點甘露醇單獨干預組，比較差異有顯著性意義(P<0.01)(見表3)。

2.3.2 TNF-α與IL-1β實驗結(jié)果相似，造模后24 h,各腦出血模型組TNF-α平均積分光密度值均顯著高于造模前(P<0.01)。其中，醒腦靜組與甘露醇6 h+醒腦靜組TNF-α平均積分光密度值均低于模型對照組(P<0.01)。而單獨應用甘露醇的6 h組TNF-α平均積分光密度值與模型對照組比較未見明顯差異(P>0.05)。造模后72 h與1 w時，各組實驗鼠TNF-α平均積分光密度值均較24 h顯著降低(P<0.01),且均低于模型對照組，比較差異有顯著性意義(P<0.01)。其中，在72 h時，3組醒腦靜聯(lián)合甘露醇實驗鼠TNF-α平均積分光密度值均顯著低于模型對照組(P<0.01),且均顯著低于同時間點甘露醇單獨干預組(P<0.01)(見表4)。

表1 各組不同時間神經(jīng)功能缺損評分的比較(分，

與同時間假手術(shù)組相比*P<0.01；與同時間模型對照組相比#P<0.05，與同時間模型對照組相比##P<0.01；與同時間甘露醇24 h組相比△P<0.05

表2 各組不同時間腦含水量的比較

與同時間假手術(shù)組相比*P<0.01；與同時間模型對照組相比#P<0.05，與同時間模型對照組相比##P<0.01；與同時間甘露醇6 h+醒腦靜組相比△P<0.05；與同時間甘露醇48 h+醒腦靜組相比P<0.05

表3 各組不同時間IL-1β平均積分光密度值表達的比較(吸光度值，

與同時間假手術(shù)組相比*P<0.01；與同時間模型對照組相比##P<0.01；與同時間甘露醇6 h組相比△△P<0.01；與同時間甘露醇24 h組相比▽▽P<0.01；與同時間甘露醇48 h組相比&&P<0.01

表4 各組不同時間TNF-α平均積分光密度值表達的比較(吸光度值，

與同時間假手術(shù)組相比*P<0.01；與同時間模型對照組相比##P<0.01；與同時間甘露醇6 h組相比△P<0.05，與同時間甘露醇6 h組相比△△P<0.01； 與同時間甘露醇24 h組相比▽▽P<0.01；與同時間甘露醇48 h組相比&&P<0.01

3 討 論

腦水腫是腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)后神經(jīng)元經(jīng)受第二次打擊的中心環(huán)節(jié)，也是ICH后繼發(fā)性腦損傷的主要標志，通過破壞腦組織的血供和神經(jīng)細胞內(nèi)環(huán)境紊亂等加重神經(jīng)細胞損傷。甘露醇是治療腦出血后顱內(nèi)壓增高的首選藥物，其通過迅速提高血漿滲透壓而抑制腦脊液生成、降低斑黏度、清除自由基等機制，降低顱內(nèi)壓并發(fā)揮腦保護作用[6]。國外有研究報道腦出血早期血腫擴大發(fā)生率高達38%[7]，對于有活動性腦出血的患者，由于甘露醇可使組織間液的水分向血漿內(nèi)轉(zhuǎn)移，容易誘發(fā)或加重腦出血，故而應盡量避免過早使用甘露醇，大多數(shù)學者主張12～24 h后應用[8]。也有研究報道，在腦出血6～24 h應用甘露醇的療效相對超早期和延期用藥較好，可降低繼續(xù)出血/再出血發(fā)生率，且安全性相當[9]。目前關(guān)于腦出血急性期甘露醇開始應用最佳時機尚未有定論。亦有研究顯示甘露醇并不能改變腦出血患者的臨床預后[1]。因此，如何恰當?shù)厥褂酶事洞级@得最好的降顱壓效果并能減少其副作用，是臨床函待解決的問題。

醒腦靜注射液源于安宮牛黃丸改制而成，具有開竅醒腦、清熱解毒、涼血活血的功效。醒腦靜可顯著抑制腦出血后早期腦組織炎性因子的表達、降低顱內(nèi)壓、減輕腦水腫、清除自由基反應及促進腦細胞康復等作用[10]。最新研究報道，醒腦靜聯(lián)合甘露醇治療腦出血有一定的臨床療效，可減少血腫量，改善患者神經(jīng)功能[2]。但該研究并未對甘露醇的劑量及用藥時間做出統(tǒng)計分析。本研究采用腹腔注射醒腦靜，不同時間尾靜脈注射甘露醇，觀測不同組合干預對 ICH 的保護作用，以探討甘露醇聯(lián)合醒腦靜治療腦出血的最佳介入時間。

本研究數(shù)據(jù)顯示，造模后24 h各腦出血模型組均出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀體征，神經(jīng)功能缺損評分均顯著高于假手術(shù)對照組(P<0.01)，表明造模成功可靠。其中，醒腦靜組評分為低于模型對照組(P<0.01)，改善了腦出血模型鼠神經(jīng)功能缺損。而單獨應用甘露醇的6 h組評分與模型對照組比較未見明顯差異(P>0.05)，可見超早期給與甘露醇未能對腦出血模型鼠神經(jīng)功能缺損起到改善作用。造模后72 h及1 w，僅醒腦靜聯(lián)合24 h給與甘露醇干預組評分顯著低于模型對照組與甘露醇24 h組(P<0.05)。說明醒腦靜聯(lián)合24 h給與甘露醇干預對腦出血模型鼠神經(jīng)功能缺損起到改善作用最顯著。腦出血血腫周圍的IL-1β和TNF-α是引起炎癥反應的主要因子[11]。TNF-α 是 ICH 血腫周圍大量表達的多效促炎因子,使血腫周圍的炎癥反應不斷加劇,破壞血-腦脊液屏障的完整性，使其通透性增加導致腦水腫和腦細胞損害[12]。在ICH 病理過程中，IL-1β能夠激活血液中的白細胞，使其經(jīng)過一系列復雜的機制穿過血管內(nèi)皮細胞游離至出血灶內(nèi)及其周圍，通過釋放血栓烷素和內(nèi)皮素等有毒物質(zhì)加重血腫周圍的繼發(fā)性損害[11]。

本研究IL-1β、TNF-α平均積分光密度值結(jié)果顯示，假手術(shù)組術(shù)后與術(shù)前比較腦水含量及IL-1β、TNF-α表達有升高趨勢，但無顯著性差異。表明假手術(shù)組大鼠的腦組織雖有一定創(chuàng)傷，但未形成明顯腦水腫。而腦出血模型對照組大鼠腦水含量從腦出血后第l天開始升高，出血后3 d達到峰值，之后逐漸下降。

IL-1β、TNF-α表達與腦組織水含量有較好的一致性，峰值出現(xiàn)時間有所提前，各組于腦出血后1 d開始升高即達到峰值，出血后3 d逐漸下降。進一步驗證了IL-1β、TNF-α參與腦出血后腦水腫的形成，并與腦水腫密切相關(guān)。甘露醇24 h+醒腦靜組在72 h、1 w時檢測炎性因子IL-1β、TNF-α的表達強度均值為各組最低，顯著低于同時間點模型對照組與甘露醇24 h組 (P<0.01)。相對應的，甘露醇24 h+醒腦靜組在72 h與1 w時的腦組織水含量均值為各出血模型組最低值，分析顯示低于同時間點模型對照組，比較差異有顯著性意義(P<0.01)。提示在造模后72 h與1 w，醒腦靜聯(lián)合24 h給與甘露醇干預能夠下調(diào)IL-1β、TNF-α的表達，減輕出血大鼠灶周水腫，改善神經(jīng)功能缺損，其療效優(yōu)于單獨給于醒腦靜或其他時間聯(lián)合甘露醇介入治療。

我們的研究結(jié)果提示，在腦出血后早期使用醒腦靜，并于24 h開始聯(lián)合使用甘露醇，既能有效抑制炎癥因子、保護血腦屏障、緩解腦水腫，又能避免過早降低顱內(nèi)壓由此而引發(fā)的再出血，二者起協(xié)同作用，通過不同環(huán)節(jié)共同控制腦水腫，為臨床上聯(lián)合用藥提供了具體指導及理論依據(jù)。