IL-2、IL-2Rα 及 IFN-γ 基因多態(tài)性與漢族兒童支氣管哮喘的關(guān)聯(lián)

鄭緒陽 陳岳明 劉占利 湯慧芳 黃先玫 楊一華 盛文彬

支氣管哮喘是兒童常見的變態(tài)反應(yīng)性疾病，嚴(yán)重影響兒童的身心健康。全球范圍內(nèi)哮喘發(fā)病日益增高，目前約有3.34億人罹病[1]，2010年我國兒童哮喘協(xié)作組調(diào)查顯示我國城區(qū)0～14歲兒童哮喘總患病率為3.02%（95%CI:2.97% ～3.06%）[2-3]。Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)病的一個(gè)重要機(jī)制[4]。研究顯示，中度持續(xù)性哮喘患者血清sIL-2Rα水平明顯高于輕度持續(xù)性哮喘患者，而哮喘患者血清 IFN-γ 水平下降[5-7]。IL-2（rs6822844 G/T）、IL-2Rα（rs2104286 A/G）及 IFN-γ（rs2430561 T/A）基因多態(tài)性已被報(bào)道與一些Th1/Th2失衡相關(guān)疾病有關(guān)聯(lián)，但與兒童支氣管哮喘的發(fā)生目前還尚不明確[8-11]。因此，本研究以支氣管哮喘漢族兒童為研究組，以漢族無支氣管哮喘兒童作為對(duì)照組，通過分析兩組兒童IL-2（rs6822844）、IL-2Rα（rs2104286）及 IFN-γ（rs2430561）多態(tài)性位點(diǎn)等位基因頻率、基因型分布差異，旨在明確上述多態(tài)性位點(diǎn)與漢族兒童支氣管哮喘發(fā)生的關(guān)聯(lián)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2010年8月至2013年12月在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院兒科急診、門診及住院漢族患兒。依據(jù)2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組修訂的《兒童哮喘防治常規(guī)》確診為支氣管哮喘的急性發(fā)作期兒童144例為研究組，男79例，女65例，年齡6個(gè)月～11歲，中位數(shù)3.7歲；病程2個(gè)月～7年，中位數(shù)2.4年。選擇同期門、急診及住院的228例漢族無支氣管哮喘兒童為對(duì)照組，男 123例，女105例，年齡6個(gè)月～10歲，中位數(shù)3.2歲，無呼吸道及其它部位感染以及過敏反應(yīng)史。兩組患兒均排除并發(fā)有呼吸衰竭、心力衰竭、先天性心臟病等。兩組患兒性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究獲得浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血標(biāo)本收集及基因組DNA提取 所有患兒采集晨起空腹EDTA.K2抗凝靜脈血2ml各2管。其中1管用于基因組DNA提取，采用全血基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），按照說明書進(jìn)行操作，提取的DNA樣本采用紫外分光光度法（260/280比值）確定DNA的純度，光密度（OD）260測(cè)定DNA的濃度，置-20℃冷凍備用。另1管2 000r/min離心10min后，取血漿1ml置-20℃冷凍備用。取A260/280比值為1.7~2.0的 DNA標(biāo)本用于后續(xù)PCR-RFLP基因分型研究。

1.2.2 PCR-RFLP聯(lián)合測(cè)序法檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性根據(jù)Genebank基因庫序列信息，在IL-2（rs6822844 G/T）、IL-2Rα（rs2104286 A/G）及 IFN-γ（rs2430561 T/A）的位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物。引物均經(jīng)在線軟件設(shè)計(jì)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/），由上海輝睿生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系包括：10×buffer（Mg2+free）5μl，dNTP（10mmol/L）4μl，Mg2+（25mmol/L）3μl，正向引物（10nmol/L）1μl，反向引物（10nmol/L）1μl，模板 DNA 5μl，Taq 酶（5U/μl）1μl，用去離子水補(bǔ)齊至50μl反應(yīng)體系（大連TakaRa生物技術(shù)有限公司）。引物序列及PCR擴(kuò)增條件見表1。PCR產(chǎn)物由上海生物工程有限公司完成，測(cè)序引物均為正向引物。基因型鑒定：取適量PCR產(chǎn)物行限制性內(nèi)切酶消化，37℃室溫育16h，終止酶切反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)判定結(jié)果。對(duì)其中部分基因型的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行膠回收、過柱純化，送上海生工生物公司作DNA測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 IL-2Rα mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 按基因分型結(jié)果，隨機(jī)抽取研究組中AA基因型、AG基因型標(biāo)本各50份。用TRIzol（美國英維捷基）提取全血總RNA，按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（立陶宛Fermentas）說明書操作合成cDNA。SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)IL-2Rα mRNA相對(duì)表達(dá)量，PCR擴(kuò)增引物分別為：正向引物5'-GGTCCCAGGCAGAGAATCAT，反向引物5'-CACCTTGTGTGTCCACCTGTA；以βactin基因作為內(nèi)參照，正向引物5'-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3'，反向引物5'-AAGGAAGGCTGGAA－GAGTGC-3'。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑購自中國大連TakaRa生物技術(shù)有限公司，反應(yīng)體系按說明書進(jìn)行配制。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：95℃3min后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，包括 95℃ 10s，60℃ 34s。根據(jù) 2-ΔΔct法來計(jì)算 IL-2Rα mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 血漿sIL-2Rα水平檢測(cè) 上述研究組中AA基因型、AG基因型標(biāo)本各50份標(biāo)本對(duì)應(yīng)的血漿sIL-2Rα水平檢測(cè)采用ELISA法（美國Creative Diagnostics）。該試劑檢測(cè)線性范圍31.25~2 000 pg/ml，檢測(cè)下限為16 pg/ml。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。Hardy-Weinberg遺傳平衡定律吻合度檢驗(yàn)、病例與對(duì)照組基因型和等位基因頻率分布比較均采用χ2檢驗(yàn)；關(guān)聯(lián)分析采用95%可信區(qū)間（CI）的比值比（OR）表示。對(duì)照組不同基因型個(gè)體組間IL-2Rα mRNA相對(duì)表達(dá)量及血漿sIL-2Rα水平采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 候選基因位點(diǎn)等位基因頻率及基因型分布 本研究中未發(fā)現(xiàn)IL-2（rs6822844）位點(diǎn)有多態(tài)性分布，其余2個(gè)位點(diǎn)的等位基因及基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。IL-2Rα（rs2104286）位點(diǎn)等位基因A在研究組分布頻率（86.8%）高于對(duì)照組（79.4%）（OR=1.708，95%CI：1.113~2.629，P=0.010）；研究組中 AA 基因型患者分布頻率（75.0%）高于對(duì)照組（62.3%）（OR=1.745，95%CI：1.058~2.884，P=0.021）。IFN-γ（rs2430561）位點(diǎn)等位基因及基因型頻率在兩組中分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.182、0.205、0.421），詳見表 2。

表2 3個(gè)候選基因位點(diǎn)等位基因頻率及基因型分布[例（%）]

圖1 IL-2Rα（rs2104286）位點(diǎn)不同基因型個(gè)體外周血IL-2Rα mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.2 IL-2RA mRNA相對(duì)表達(dá)量 經(jīng)SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)IL-2Rα mRNA相對(duì)表達(dá)量，AA基因型攜帶者相對(duì)表達(dá)量（1.263±0.625）明顯高于AG基因型攜帶者（1.044±0.436）（P=0.043），詳見圖 1。

2.3 血漿sIL-2Rα水平 結(jié)果顯示，AA基因型個(gè)體血漿sIL-2Rα水平（157.86±67.21）明顯高于AG基因型個(gè)體（126.41±58.63）（P=0.018），詳見圖 2。

圖2 IL-2Rα（rs2104286）位點(diǎn)不同基因型個(gè)體血漿sIL-2Rα水平

3 討論

研究表明，支氣管哮喘是多種炎癥因子引起的慢性氣道炎癥。Thl/Th2失衡是哮喘發(fā)病的一個(gè)重要機(jī)制[4]。IL-2和IFN-γ是Thl型細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子。IL-2Rα在維持免疫系統(tǒng)功能方面起關(guān)鍵作用[5]。IL-2Rα脫落入血液后形成可溶性IL-2Rα（sIL-2Rα）。研究顯示支氣管哮喘患者肺泡灌洗液IL-2水平明顯升高，并且中度持續(xù)性哮喘患者血清sIL-2Rα也明顯高于輕度持續(xù)性哮喘患者，而哮喘患者血清IFN-γ水平下降[6-7]。細(xì)胞因子的合成受遺傳因素的影響[7-10]，細(xì)胞因子的合成受遺傳因素的影響，Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4、IL-13等細(xì)胞因子基因多態(tài)性與哮喘發(fā)生有明顯關(guān)聯(lián)，如Li等[7]通過病例對(duì)照研究顯示IL-4-589 C/T多態(tài)性與哮喘易感性有關(guān)聯(lián)；Braddock 等[8]發(fā)現(xiàn) IL-13 Arg130Gln（rs20541）和G（rs1295685）基因多態(tài)性與哮喘易感性和血清IgE水平相關(guān)。IL-2（rs6822844 G/T）、IL-2Rα（rs2104286 A/G）及IFN-γ（rs2430561 T/A）基因多態(tài)性已被報(bào)道與一些Th1/Th2失衡相關(guān)疾病有關(guān)聯(lián)，但與兒童支氣管哮喘的發(fā)生目前還尚不明確[11-12]。

IL-2主要由Th1細(xì)胞分泌，人IL-2基因位于4號(hào)染色體（4q27），而IFN-γ基因位于12號(hào)染色體長臂（12q24.1），這些基因編碼可能會(huì)導(dǎo)致在相應(yīng)的細(xì)胞因子的表達(dá)變化，從而導(dǎo)致Th1/Th2失衡。如IL-2（rs6822844）多態(tài)性與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化癥[13-14]；支氣管哮喘患者IL-2水平明顯升高[6,12,15]。研究報(bào)道IL-2基因存 在 多 態(tài) 性 （rs6822844，rs6534349，rs2069762 和rs3136534），本研究納入 IL-2（rs6822844）、IL-2Rα（rs2104286）及 IFN-γ（rs2430561）作為候選多態(tài)性位點(diǎn)，結(jié)果表明，IFN-γ（rs2430561）位點(diǎn)與支氣管哮喘發(fā)病無明顯關(guān)聯(lián)，并且在本研究的樣本量內(nèi)未發(fā)現(xiàn)IL-2（rs6822844）位點(diǎn)在中國漢族兒童有多態(tài)性分布。

IL-2R基因位于10號(hào)染色體短臂（10p15.1），IL-2受體由3個(gè)亞單位組成，包括α亞基（IL-2R；CD25），β亞基（IL-2Rβ；CD122）和 γ 亞基（γC；cd132）。IL-2Rα在維持免疫系統(tǒng)的功能發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，與IL-2Rβ 和 γC 亞基和細(xì)胞因子（IL-2、IL-4、IL-7，IL-9，IL-15和IL-21聯(lián)合在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮作用[5]。IL-2Rα釋放到血液中的可溶性IL-2Rα形成后（sIL-2R）。在中度持續(xù)性哮喘患者，血清sIL-2Rα水平顯著高于輕度持續(xù)性哮喘患者[6,12,15]。在以往的研究中，IL-2Rα（rs2104286）作為候選基因多態(tài)性與Th1/Th2疾病[16]和1型糖尿病和幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的失衡有關(guān)；然而，這些位點(diǎn)與支氣管哮喘的關(guān)系尚未見報(bào)道，尤其是中國的孩子。

IL-2R（rs2104286）位點(diǎn)位于基因的第一個(gè)內(nèi)含子。Struja等[17]報(bào)道稱，AA基因型患者血清sIL-2R水平顯著高于其他基因型（P=0.012）在對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義之間的基因型在甲狀腺功能亢進(jìn)組。本研究運(yùn)用性別、年齡配對(duì)的病例對(duì)照研究，通過PCR產(chǎn)物測(cè)序的方法分別鑒定了144例漢族支氣管哮喘患兒及228例無支氣管哮喘兒童上述3個(gè)基因位點(diǎn)等位基因頻率、基因型分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-2Rα（rs2104286）位點(diǎn)等位基因A相對(duì)于 G是致病基因（OR=1.708，95%CI：1.113~2.629，P=0.010）；AA基因型個(gè)體患病風(fēng)險(xiǎn)高于AG基因型個(gè)體（OR=1.745，95%CI:1.058~2.884，P=0.021）。本研究還發(fā)現(xiàn)，在研究組中IL-2Rα（rs2104286）位點(diǎn)AA基因型個(gè)體外周血IL-2RA mRNA相對(duì)表達(dá)量以及血漿sIL-2Rα水平均顯著高于AG基因型（P=0.043、0.018），提示rs2104286可能是IL-2Rα基因的一個(gè)功能性位點(diǎn)。許多自身免疫性疾病中CD25單抗在降低疾病活動(dòng)性方面已顯示出很好的療效，其效應(yīng)不僅直接作用于T細(xì)胞，而且作用于NK細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[18]。最近，關(guān)于哮喘患者炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)細(xì)胞因子的作用，研究人員還認(rèn)為，IL-2受體拮抗劑可用于治療哮喘[19]的新策略。

總之，本研究表明IL-2R（rs2104286）位點(diǎn)可能與漢族兒童支氣管哮喘的發(fā)生有關(guān)，和網(wǎng)站可以影響哮喘的表達(dá)。結(jié)果表明，IL-2受體可能是一種潛在、有效的哮喘治療目標(biāo)，其基因型的臨床意義在指導(dǎo)個(gè)體化用藥。