miR-106b對(duì)脂多糖誘導(dǎo)活化的人單核巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的影響及機(jī)制研究

陳軍 周盈盈 陳黎黎 趙初環(huán)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，闡明其發(fā)病機(jī)制是當(dāng)前亟待解決的重大問(wèn)題[1]。目前，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥過(guò)程的論點(diǎn)已經(jīng)被普遍認(rèn)可[2-3]。其中，人單核巨噬細(xì)胞（THP1）主導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，但其炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全闡明[4]。TNF-α是主要由人THP1分泌的促炎癥細(xì)胞因子，它可以直接或間接損害血管內(nèi)皮，促進(jìn)血管炎癥及血栓形成。研究證實(shí)，在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的過(guò)程中，TNF-α起著重要作用[5]。微小RNA（microRNA，miRNA）是近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)參與心血管調(diào)節(jié)的一類(lèi)非編碼小RNA[6]，研究表明miRNA對(duì)炎癥具有重要的調(diào)節(jié)作用[7]。前期我們通過(guò)miRNA基因芯片，分析對(duì)比了人THP1活化前后miRNA的表達(dá)譜變化，發(fā)現(xiàn)人THP1活化后miR-106b出現(xiàn)高表達(dá)。因此，本文擬在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)人THP1炎癥反應(yīng)的細(xì)胞模型中，研究miR-106b對(duì)人THP1分泌TNF-α的調(diào)節(jié)作用及其可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑 THP1由中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)上海細(xì)胞庫(kù)提供；FBS（美國(guó)Gbico公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基、Opti-MEMI培養(yǎng)基、脂質(zhì)體2000（美國(guó)Invitrogen公司）；LPS（TLR4刺激劑，美國(guó) Sigma公司）；miR-106b mimic、NC mimic（上海吉瑪生物有限公司）；人TNF-αELISA試劑盒（美國(guó)Ebioscience公司）；miRNA逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR試劑盒（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司）；抗SIRPα-APC熒光標(biāo)記抗體（美國(guó)BD公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及刺激 將THP1細(xì)胞用1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于 24孔板，LPS 1μg/ml刺激。分別于 0、6、12h 收集細(xì)胞，Trizol法抽提RNA，熒光定量PCR檢測(cè)miR-106b表達(dá)量；于24h后收集細(xì)胞上清液，測(cè)上清液TNF-α表達(dá)量，另設(shè)陰性對(duì)照進(jìn)行比較。

1.3 分組和miRNA轉(zhuǎn)染 重新取THP1細(xì)胞，分為L(zhǎng)PS組、NC對(duì)照組和miR-106b組3組。LPS組，THP1細(xì)胞不轉(zhuǎn)染，單用 LPS（1μg/ml）刺激 24h；NC 對(duì)照組，每孔細(xì)胞中加入NC mimic（與靶基因序列不相符）100nmol轉(zhuǎn)染后，LPS（1μg/ml）刺激 24h；miR-106b 組，每孔細(xì)胞中加入miR-106b mimic 100nmol轉(zhuǎn)染后，LPS（1μg/ml）刺激 24h。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照 Invitrogen公司Lipofectamin2000說(shuō)明進(jìn)行操作:（1）miRNA和Lipofectamin2000（1μl/孔）分別溶于 50μl的 opti-MEM 無(wú)血清培液中5min，混勻；（2）將上述兩者等體積混勻15 min；（3）將上述混合液按照每孔 100μl加入細(xì)胞中；（4）培養(yǎng)4h后，更換為完全培養(yǎng)基，加入1μg/ml的LPS刺激24h，然后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。LPS(1μg/ml)刺激24h后，檢測(cè)各組THP1細(xì)胞上清液TNF-α的表達(dá)量。

1.4 miRNA靶蛋白預(yù)測(cè) 為進(jìn)一步明確miR-106b在THP1細(xì)胞分泌TNF-α異常的通路中可能的作用機(jī)制，我們采用在線(xiàn)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)工具Targetscan version5.1生物信息學(xué)分析系統(tǒng)初步預(yù)測(cè)其可能的靶蛋白以及它們可能的作用位點(diǎn)，預(yù)測(cè)miR-106b可能調(diào)控的靶基因。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣本細(xì)胞靶蛋白表達(dá)量 每個(gè)樣本均準(zhǔn)備兩份，每份1×105個(gè)細(xì)胞，約20~30μl體積。LPS組、NC對(duì)照組、miR-106b組均加入0.3μl用APC標(biāo)記的抗SIRPα抗體染色；另設(shè)陰性對(duì)照組（neg組，不染色），4℃孵育30min左右。用1ml加有0.2%FBS的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌上述反應(yīng)混合液，1 700r/min離心5min，重復(fù)上述步驟1次。然后用200μlPBS懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料均以表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，方差齊者兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),方差不齊者采用 Tamhane′sT2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。作圖采用GraphPad Prism 6軟件。

2 結(jié)果

2.1 LPS刺激 0、6、12h后 THP1細(xì)胞 miR-106b的表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖1。

圖1 LPS刺激0、6、12h后THP1細(xì)胞miR-106b的表達(dá)水平比較

由圖 1可見(jiàn)，LPS刺激 6、12h后 THP1細(xì)胞miR-106b表達(dá)水平均明顯升高（均P＜0.01），且6h時(shí)＞12h時(shí)（均P＜0.01）。

2.2 LPS刺激24h后THP1細(xì)胞上清液TNF-α表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖2。

圖2 LPS（1μg/ml）刺激 24h后THP1細(xì)胞上清液TNF-α表達(dá)水平比較（**P＜0.01）

由圖 2 可見(jiàn)，LPS（1μg/ml） 刺激 24h 后，LPS 組THP1細(xì)胞上清液TNF-α表達(dá)水平與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示采用TLR4刺激劑LPS活化THP1細(xì)胞的體系構(gòu)建成功。

圖3 3組細(xì)胞上清液TNF-α表達(dá)水平比較（*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3 3組細(xì)胞上清液TNF-α表達(dá)水平比較 見(jiàn)圖3。

由圖3可見(jiàn)，與LPS組和NC對(duì)照組比較，miR-106b組THP1上清TNF-α表達(dá)水平明顯增多（均P＜0.05）；NC對(duì)照組與LPS組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.4 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-106b作用靶蛋白 經(jīng)Targetscan Version 5.1生物信息學(xué)分析系統(tǒng)初步預(yù)測(cè)，其可能的靶蛋白為信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α（SIRPα），它們可能的作用位點(diǎn)見(jiàn)圖4。

圖4 miR-106b作用靶蛋白及作用位點(diǎn)預(yù)測(cè)（矩形圖為miR-106b靶基因SIRPα mRNA結(jié)構(gòu)圖，miR-106b可與 SIRPα5'UTR區(qū)結(jié)合而發(fā)揮調(diào)控作用，target site為miR-106b作用于SIRPα?xí)r的結(jié)合位點(diǎn)GCACUUU）

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組THP1細(xì)胞SIRPα表達(dá)水平 見(jiàn)圖5。

圖5 檢測(cè)各組THP1細(xì)胞SIRPα表達(dá)水平的流式細(xì)胞圖

由圖5可見(jiàn)，與NC對(duì)照組和LPS組比較，miR-106b組的THP1細(xì)胞SIRPα表達(dá)水平明顯下降（均P＜0.05）。

3 討論

本研究通過(guò)體外脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)miR-106b等方法，發(fā)現(xiàn)該miRNA可促進(jìn)人THP1分泌TNF-α。為進(jìn)一步明確miR-106b在THP1分泌TNF-α異常的通路中可能的作用機(jī)制，采用生物信息學(xué)分析初步預(yù)測(cè)其可能的靶蛋白為SIRPα，并采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)miR-106b可通過(guò)抑制靶蛋白SIRPα表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)THP1細(xì)胞活化后分泌TNF-α的量。miRNA是近年發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)長(zhǎng)約19～22個(gè)堿基的單鏈非編碼小分子RNA。研究顯示，miRNA是一類(lèi)重要的負(fù)調(diào)控因子。成熟的miRNA通過(guò)核酸序列互補(bǔ)結(jié)合到靶mRNA非編碼區(qū)來(lái)抑制翻譯或促進(jìn)靶mRNA的降解，從而起到負(fù)調(diào)節(jié)作用，其在固有免疫，適應(yīng)性免疫及炎癥因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中都起著重要作用[8-9]。

已有研究顯示，miRNA參與調(diào)控心血管疾病的發(fā)病過(guò)程。研究證實(shí)，miRNA可以通過(guò)細(xì)胞和分子水平來(lái)改變靶基因的表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控心血管相關(guān)的一些重要生物學(xué)過(guò)程，包括血管的形成、細(xì)胞的分化和增殖以及凋亡等[10]。同時(shí)，研究表明，miRNA也可調(diào)控心血管疾病相關(guān)炎癥因子的表達(dá)。Zhu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可以通過(guò)抑制氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表達(dá)TNF-α、IL-6等炎癥因子，進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。Sun等[11]研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-181b可以抑制載脂蛋白E敲除（apolipoprotein-E deficiency，ApoE-/-）小鼠體內(nèi) TNF-α、IL-1β 等促炎癥因子的表達(dá)，抑制小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊的形成。目前對(duì)miR-106b的功能研究主要集中在腫瘤免疫方面。miR-106b可以通過(guò)作用于腫瘤抑制基因 RBL1、RBL2、CASP8增加膠質(zhì)瘤的發(fā)生率[12]。而其過(guò)表達(dá)可以通過(guò)激活上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移[13]。近年來(lái)，Tang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-106b還可以對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞起調(diào)控作用。miR-106b可以抑制卵清蛋白誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞的促過(guò)敏及隨后的Th2細(xì)胞的極化，對(duì)過(guò)敏性炎癥性疾病具有治療作用。而樹(shù)突狀細(xì)胞已被證實(shí)在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中起著重要作用。在ApoE-/-動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型中，漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞起到關(guān)鍵的促動(dòng)脈粥樣硬化作用，而通過(guò)清除小鼠體內(nèi)漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞，可以明顯減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[15]。目前尚無(wú)關(guān)于miR-106b對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化或巨噬細(xì)胞炎癥直接調(diào)控作用的相關(guān)研究。

此外，本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析技術(shù)預(yù)測(cè)miR-106b可能的潛在靶基因?yàn)镾IRPα，并通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)進(jìn)一步從蛋白水平證實(shí)了miR-106b可以抑制THP1細(xì)胞膜表面蛋白SIRPα的表達(dá)。SIRPα是屬于免疫球蛋白超家族的I型跨膜受體，可表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等胞膜上[16]。研究發(fā)現(xiàn)，SIRPα與其配體CD47作用可以抑制巨噬細(xì)胞的吞噬作用[17]。CD47融合性蛋白可以通過(guò)作用于CD172a+（SIRPα）細(xì)胞抑制克羅恩病模型小鼠IL-1β和TNF的分泌[18]。因此，SIRPα在巨噬細(xì)胞以及其炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。研究顯示，巨噬細(xì)胞及其炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中扮演著重要角色。巨噬細(xì)胞可通過(guò)分泌單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1），募集單核細(xì)胞和更多的巨噬細(xì)胞到血管壁，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬形成[19]。Liu等[20]發(fā)現(xiàn)，SIRPα可以抑制β2整合素介導(dǎo)的人THP1的黏附、遷移和吞噬作用，進(jìn)而可能抑制動(dòng)脈粥樣硬化早期血管壁上的人THP1過(guò)度激活與聚集。

本研究通過(guò)采用體外LPS誘導(dǎo)活化人THP1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)活化的THP1細(xì)胞可分泌大量TNF-α。體外過(guò)表達(dá)miR-106b后，其可促進(jìn)THP1細(xì)胞分泌TNF-α。本研究闡明了miR-106b在人THP1分泌TNF-α過(guò)程中的作用，拓寬了對(duì)miRNA在調(diào)控巨噬細(xì)胞炎癥網(wǎng)絡(luò)的了解，有助于進(jìn)一步了解動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病，特別是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)病機(jī)制，并為此類(lèi)疾病的分子靶向治療提供理論依據(jù)。