影響宰后魚肉能量代謝和質(zhì)構的酶及其活性測定方法研究進展

孫蕾蕾，黃 卉，李來好,* ，楊賢慶，郝淑賢，岑劍偉，楊少玲，趙永強

（1.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室，國家水產(chǎn)品加工技術研發(fā)中心，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306）

影響宰后魚肉能量代謝和質(zhì)構的酶及其活性測定方法研究進展

孫蕾蕾1,2，黃 卉1，李來好1,* ，楊賢慶1，郝淑賢1，岑劍偉1，楊少玲1，趙永強1

（1.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室，國家水產(chǎn)品加工技術研發(fā)中心，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306）

宰后魚肉在低溫貯藏過程中會發(fā)生一系列物理、化學和微生物方面的變化。研究發(fā)現(xiàn)，宰后魚肉能量代謝和質(zhì)構變化與肌肉中的多種內(nèi)源性水解酶相關。本文綜述了4 種肌肉酶，即與能量代謝相關的三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatase，ATPase）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和與質(zhì)構相關的鈣激活蛋白酶、溶酶體組織蛋白酶的結(jié)構特點及其分離純化和活性測定，為建立宰后魚肉能量代謝和品質(zhì)分析的酶學方法提供參考。

魚肉；肌肉酶；能量代謝；質(zhì)構；酶活性

目前，我國漁業(yè)特別是淡水漁業(yè)產(chǎn)量逐年增加，市場上除了部分以活魚流通外，大部分是以低溫貯藏水產(chǎn)加工制品，如生魚片等，實現(xiàn)其廣域流通。低溫貯藏作為一種水產(chǎn)品長期保藏的重要方法，它能有效抑制微生物快速繁殖并降低魚體自身水解酶的活力，但在長期的貯藏過程中魚肉仍會發(fā)生一些物理、化學及微生物方面的復雜變化，包括糖原分解、脂肪氧化酸敗、肌動蛋白和肌球蛋白間的僵直聯(lián)結(jié)弱化[1]以及由于冰晶形成、離子強度增加和蛋白水解酶導致的蛋白質(zhì)水解及變性等[2]，導致魚蛋白理化及功能特性發(fā)生變化。

魚肉的品質(zhì)一般包括四方面，即食用品質(zhì)（質(zhì)構、風味、色澤等）、加工品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)和安全品質(zhì)[3]。其中，食用品質(zhì)是決定魚肉產(chǎn)品價值的最重要因素，而食用品質(zhì)中的質(zhì)構反映了魚肉的硬度，是消費者用于評判魚肉品質(zhì)優(yōu)劣的最常用指標，它受到多種因素的影響，包括魚的大小、種類、脂肪含量和分布、蛋白質(zhì)含量等死前因素以及貯藏溫度、pH值變化、肌原纖維蛋白水解速率和程度等死后因素[4]。硬度主要由肌原纖維的結(jié)構和狀態(tài)、肌間結(jié)締組織含量和性質(zhì)決定，前者很大程度上取決于內(nèi)源性蛋白水解酶[5]，決定了肉的尸僵硬度，是導致魚肉硬度差異的關鍵因素；后者決定了肉的基礎硬度（背景硬度）[6]。

三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatase，ATPase）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）在淡水魚和半咸水魚中具有較高的活性[7]。魚體死后糖酵解的速率是由ATP酶的活性控制的，ATP酶活力的大小直接影響新陳代謝的能力，而代謝能力的強弱又與魚肉品質(zhì)相關。乳酸脫氫酶是機體能量代謝中參與糖酵解的一種關鍵酶[8]，通過調(diào)節(jié)氧化型輔酶Ⅰ（oxidized form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NAD+）和還原型輔酶Ⅰ（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH）的比率，對細胞內(nèi)一系列生化反應起調(diào)控作用[9]。大量研究表明，鈣激活蛋白酶和溶酶體組織蛋白酶參與宰后魚肉肌原纖維蛋白的水解，其活性是影響魚肉硬度等品質(zhì)的主要因素。另外一些存在于魚肉中的其他蛋白水解酶類，例如與結(jié)締組織代謝和內(nèi)肽酶有關的降解膠原蛋白和細胞骨架蛋白的基質(zhì)金屬蛋白酶、在宰后僵直和早期成熟過程中參與鈣激活蛋白酶的激活并對肌原纖維蛋白進行降解的細胞凋亡酶、參與氧化蛋白質(zhì)降解并可能通過降解細胞骨架蛋白和肌球蛋白、肌動蛋白、伴肌球蛋白等肌原纖維蛋白而參與宰后肌肉嫩化的蛋白酶體（特別是20S蛋白酶體）等均對宰后魚肉的代謝和品質(zhì)產(chǎn)生影響[10]。因此，將魚肉組織中的多種酶系統(tǒng)作為宰后魚肉能量代謝和質(zhì)構等品質(zhì)評價指標具有潛在應用價值，基于此可以建立一種品質(zhì)分析的酶學方法，為宰后魚肉的加工保藏以及品質(zhì)評價提供相關的理論依據(jù)。

1 宰后魚肉在低溫貯藏過程中的變化規(guī)律

魚在宰后貯藏過程中大致經(jīng)歷4 個階段[11]。1）死后僵直。魚體死亡后，由于組織缺氧，此時主要通過肌酸磷酸激酶和肝糖酵解途徑代替氧化磷酸化途徑合成少量ATP，隨著ATP的降解，當其含量達到特定水平（1～2 mol/g）時，肌球蛋白纖維和肌動蛋白纖維的結(jié)合變?yōu)椴豢赡鎇12]，魚體呈僵硬狀態(tài)。遠洋魚類在死后的3～18 h后就完成死后僵直階段[13]。2）解僵成熟。成熟階段早期的肌原纖維蛋白快速降解和晚期的結(jié)締組織慢速弱化使魚肉硬度降低、柔嫩多汁[14]。3）自溶階段。自溶是由存在于肌肉組織中的內(nèi)源性水解酶或來自腐敗菌的外源酶引起的，此時肌肉組織失去固有彈性。4）腐敗階段。微生物代謝活躍，產(chǎn)生了引起魚體腐敗的各種酶，蛋白質(zhì)、脂肪等分解產(chǎn)生胺類、脂肪酸、硫化氫、吲哚等具有腐臭特征的產(chǎn)物[15]。

2 魚體宰后貯藏過程中發(fā)生水解的主要肌原纖維蛋白

肌肉主要是由肌原纖維蛋白構成的，魚類中的肌原纖維蛋白含量（占總蛋白含量的60%～80%）比哺乳動物（40%）高。

在宰后魚肉的低溫貯藏過程中，肌原纖維和細胞外基質(zhì)中的關鍵結(jié)構蛋白以及在肌原纖維和肌原纖維膜間起連接作用的蛋白質(zhì)會發(fā)生降解[16]，將對肉的硬度、風味等品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。肽鏈內(nèi)切酶會顯著影響魚肉的質(zhì)地，而外肽酶能通過作用于風味變化相關的多肽類物質(zhì)對魚肉的風味等品質(zhì)產(chǎn)生影響[17]。

魚體宰后的低溫貯藏過程中會發(fā)生水解的肌原纖維蛋白主要包括肌球蛋白、肌動蛋白、肌聯(lián)蛋白、伴肌動蛋白、原肌球蛋白、肌鈣蛋白等。肌球蛋白參與肌肉收縮，其分子質(zhì)量為500 ku，是一個不對稱的六聚體蛋白，含有多個結(jié)構域和功能域。肌動蛋白是肌原纖維中參與肌肉收縮的另一種蛋白質(zhì)，是分子質(zhì)量為43 ku的球形蛋白。肌聯(lián)蛋白是肌原纖維中含量占第3位的蛋白質(zhì)，是目前已發(fā)現(xiàn)的最大蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量大約為3 000 ku，在橫紋肌細胞中至少有兩個功能，即作為粗肌絲裝配的模版以及結(jié)合到Z線的α-輔肌動蛋白上來連接粗肌絲和Z線。伴肌動蛋白是分子質(zhì)量約為700 ku的可調(diào)節(jié)肌動蛋白長度的重要蛋白質(zhì)。原肌球蛋白是細肌絲上的一種二聚體蛋白。肌鈣蛋白由3 種亞基構成，這3 種成分都能發(fā)揮其各自特定的功能，其中，肌鈣蛋白T能提供肌鈣蛋白和原肌球蛋白的結(jié)合，肌鈣蛋白C能特異性結(jié)合Ca2+，肌鈣蛋白I能抑制肌動球蛋白中的ATP酶活性。

3 能量代謝的相關酶——ATP酶和乳酸脫氫酶

3.1 ATP酶

3.1.1 ATP酶及其與能量代謝和宰后魚肉風味等品質(zhì)的關系

ATP酶主要以Na+, K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶4種形式存在于組織細胞膜及細胞器膜上，它在物質(zhì)運輸、能量代謝、離子平衡以及信息傳遞等方面發(fā)揮重要作用。其中，Na+, K+-ATP酶是主動運輸?shù)奶厥膺\載酶，能催化水解ATP并驅(qū)動Na+和K+在生物膜兩側(cè)的對向運輸[18-20]。

宰后魚肉ATP的快速降解與高活性的ATP酶有關，Watabe等[21]認為，在低溫貯藏下魚類肌漿網(wǎng)狀結(jié)構的鈣吸收能力降低，肌漿纖維內(nèi)鈣離子濃度增加。而鈣離子能激活Mg2+-ATP酶，使ATP快速降解[22]。因此，ATP酶活力的大小是評價細胞能量代謝的重要指標[23]。

低溫貯藏過程中冰晶引起的三級結(jié)構的改變、體系離子強度的增加以及蛋白質(zhì)重排可能會導致ATP酶活性的改變[24]。Na+, K+-ATP酶活性的變化能有效地反映細胞的功能和結(jié)構性狀，已成為研究魚類毒性的重要指標；Ca2+, Mg2+- ATP酶的活性是反映外源性鈣離子存在下肌動蛋白-肌球蛋白復合物完整性的重要參數(shù)；Mg2+-ATP酶的活性能表征肌動蛋白的完整性；Ca2+-ATP酶的活性能表征肌球蛋白的完整性[2,25]。因此，ATP酶活力的大小也是影響肌肉收縮張力和收縮速率的重要因素。同時，魚肉肌球蛋白頭部具有Ca2+-ATP酶活性，是反映魚肉或魚糜蛋白變性的常用指標，而蛋白質(zhì)的變性程度又往往與魚肉品質(zhì)有密切關聯(lián)[26-27]。

魚肉中的ATP在貯藏過程中由于ATP酶的作用降解為腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP），隨后在多種酶的連續(xù)催化下依次降解為腺苷酸（adenylic acid，AMP）、肌苷酸（inosinic acid，IMP）、次黃嘌呤核苷（hypoxanthine riboside，HxR）和次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx）[22]。對于大部分宰后魚肉而言，ATP的最初分解代謝通常導致IMP的暫時快速積累，使魚肉產(chǎn)生良好風味，然后這種物質(zhì)再慢慢降解為HxR，進而降解為Hx，而Hx被認為是引起異味的物質(zhì)，隨著貯藏時間的延長，Hx含量迅速上升，最終導致魚體腐敗味的產(chǎn)生[11]。因此，ATP酶活性可以作為判斷魚肉風味等品質(zhì)的最佳指標之一。

3.1.2 ATP酶的分離純化及活性測定

目前，分離純化ATP酶主要采用親和層析法，此法操作過程簡單、對于微量樣品的純化效率高、活性物質(zhì)回收率高、特異性強、操作條件溫和并能保持ATP酶在分離純化過程中的生物活性，且能用于分離純化含量極少且穩(wěn)定性不高的活性物質(zhì)[28]，但此法所用試劑價格昂貴。例如有研究報道可采用反應紅-120瓊脂糖（reactive red-120 agrose）親和層析法分離純化Ca2+-ATP酶，其基本原理是利用Ca2+-ATP酶與染料（反應紅）之間的親和作用進行分離[29]。另外，也可采用梯度離心分離純化Ca2+-ATP酶，但這種方法不僅耗時長而且活性物質(zhì)純度不高。國外的文獻也指出可采用凝膠電泳法或氯仿/甲醇提取結(jié)合色層分析的方法進行分離純化，采用前者的純化方法純度可達到95%以上[30-31]。

將肌肉組織制成粗提酶液進行ATP酶活性的測定，可通過酶促反應釋放的無機磷含量或ATP的減少量及pH值的改變來測定。目前國內(nèi)外最常用的方法是通過無機磷含量測定，該方法的基本原理是ATP酶可將ATP分解成ADP和無機磷，通過測定無機磷的含量來間接測定ATP酶的活力[23]。無機磷的測定常采用硫酸亞鐵磷鉬藍顯色法，其原理是無機磷能與鉬酸銨在酸性條件下反應并生成磷鉬雜多酸，磷鉬雜多酸被還原劑硫酸亞鐵還原后生成藍色的磷亞鉬酸復合物（磷鉬藍），采用比色法進行測定，目前該方法已有試劑盒可用，Na+, K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、Ca2+, Mg2+-ATP酶的活性均可準確測定，此法顯色穩(wěn)定、特異性強、線性范圍較寬，但靈敏度較低、還原劑不穩(wěn)定，且需要除去蛋白；另外也可通過孔雀綠單一試劑顯色法測定無機磷含量，此法可以不去除蛋白直接測定，但顯色時間較長[32]。

新鮮魚肉中ATP酶的活性較高，但隨著冷藏時間的延長其活性明顯下降且其下降趨勢符合K arl Pearson直線關系式，呈現(xiàn)負相關（P≤0.01）。此外，宰后魚肉經(jīng)過冷藏后TBA值明顯升高，與ATP酶活性明顯下降存在顯著相關性[7]。有研究結(jié)果顯示：羅非魚片在冷藏1～2 d內(nèi)，Ca2+-ATP酶活性明顯下降，在第2天酶活力為1.847 μmol Pi/（h·mg pro），下降了22.61%，在第13天為1.056 μmol Pi/（h·mg pro），下降了55.74%，之后隨著冷藏時間延長其活性下降緩慢，并且酶活性變化與揮發(fā)性鹽基氮值和K值等品質(zhì)指標有良好的相關性[33]。還有報道指出：羅非魚魚糜在新鮮狀態(tài)時的Ca2+-ATP酶活力為4.8 μmol Pi/（h·mg pro），鳙魚魚糜為10.2 μ mol Pi/（h·mg pro），在－18 ℃凍藏期間羅非魚魚糜在0～21 d內(nèi)酶活性顯著降低（P＜0.05），在21～49 d內(nèi)下降不顯著（P＞0.05），而鳙魚魚糜在整個凍藏期間酶活性均顯著降低（P＜0.05），在63 d后羅非魚和鳙魚魚糜酶活性分別下降了100%和43.5%[32]，表明不同魚肉種類之間酶的活性也存在顯著差異。

3.2 乳酸脫氫酶

3.2.1 乳酸脫氫酶及其與能量代謝和宰后魚肉品質(zhì)的關系

乳酸脫氫酶是能量代謝中參與糖酵解的一種主要酶，它以NAD+為輔酶，可逆地催化丙酮酸和NADH與乳酸和NAD+之間的反應，因此又稱為L-乳酸：NAD+氧化還原酶[34]。乳酸脫氫酶是一組由“M”和“H”兩種亞基類型組成的四聚體同工酶，這兩種亞基是被不同的基因編碼并且結(jié)合形成5 種同工酶——HHHH、HHHM、HHMM、HMMM和MMMM（分別指LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5），第6種同工酶LDHX被證實存在于睪丸中，并且被認為是一個第三基因座的產(chǎn)物[35]。LDH1和LDH2主要存在于心臟中，有助于實現(xiàn)從乳酸到丙酮酸的轉(zhuǎn)化；而LDH4和LDH5主要存在于肝臟和骨骼肌中，有助于逆反應生成乳酸[36]，完成糖酵解過程，為機體在缺氧條件下提供能量[37]。

乳酸脫氫酶催化的丙酮酸與乳酸之間的可逆反應的速率決定于介質(zhì)中的pH值，且這種決定作用對于正逆反應是不同的[38]。pH值的改變能影響酶活性中心上必需基團及底物和輔酶的解離程度，從而影響酶與底物的結(jié)合和催化特性。

乳酸脫氫酶作為糖酵解的末端酶，其活性的改變將直接影響到機體的能量代謝[8]。另外，魚體在冷藏過程中其硫代巴比妥酸（thibarbituric acid，TBA）值、過氧化值等與乳酸脫氫酶的活力存在相關性，因此，乳酸脫氫酶也可作為衡量魚肉早期變質(zhì)程度的一個指標。

3.2.2 乳酸脫氫酶的分離純化及活性測定

乳酸脫氫酶的分離純化常采用親和層析法，原理是利用酶與載體之間的特異性作用，該法效率高，但成本高且操作較繁瑣。也有其他分離純化方法的相關報道，例如利用離子交換層析柱、羥磷灰石吸附劑和Superdex Hr-200純化出絲蟲（Molinema dessetae）的LDH1和LDH2同工酶[37,39]。另外，也可采用淀粉凝膠電泳法（垂直淀粉凝膠電泳分離LDH1和LDH2同工酶；水平淀粉凝膠電泳分離LDH3和LDH4同工酶）[5,34]或硫酸銨沉淀、離子交換層析和疏水層析的混合方法進行高效純化，此混合方法能得到比活力和得率都較高的LDH。乳酸脫氫酶的等電點在5.0附近，其最適pH值為6.5，因此乳酸脫氫酶帶負電荷，可用二乙胺基乙基纖維素（diethylaminoethyl cellulose，DEAE）陰離子交換劑進行純化分離；同時，乳酸脫氫酶疏水力較強，故可采用疏水層析進一步分離純化[40- 41]。

乳酸脫氫酶活性的測定方法有多種，目前較多采用分光光度法。乳酸脫氫酶測試盒法即是基于分光光度法的原理，通過乳酸脫氫酶催化底物反應產(chǎn)生丙酮酸，然后與2,4-二硝基苯肼顯色劑反應，生成的腙類化合物在堿性溶液中呈現(xiàn)紅棕色，再通過比色可求得酶活力[8]；或者利用NADH在340 nm波長處有最大吸收峰，而NAD+沒有吸收峰，因此可以通過NADH的減少或增加量即通過檢測340 nm波長處吸收峰值的變化值來間接定量乳酸脫氫酶的活性[42]；也可以利用NADH與吩嗪硫酸甲酯和硝基四唑藍進行反應生成甲臜，通過測定甲臜的吸光度值來間接測定酶活力。另外Keyhani等[43]利用鐵氰化鉀在420 nm波長處有吸收峰間接測定出了藏紅花莖中的乳酸脫氫酶活力。分光光度法操作簡單、快速，但選擇性較差，也不適用于有顏色樣品的測定[44]。除了使用分光光度法外，也有使用手工目測法和丙酮酸氧化酶電極、修飾了亞甲基綠的碳纖維電極或示差脈沖伏安法等基于電化學方法的相關報道，電化學方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、選擇性強、不易受到介質(zhì)顏色的干擾等優(yōu)點，例如采用電流法的檢測限達10 U/mL，線性范圍為15～240 U/mL[45]，但制備有效電極過程較為繁瑣。另外，也可利用NADH本身具有熒光特性（最大激發(fā)波長為350 nm，最大發(fā)射波長為460 nm），從而利用熒光強度變化直接定量乳酸脫氫酶的活性，有研究結(jié)果顯示：當NADH濃度在50～300 μmol/L范圍時其熒光強度與濃度呈較好的線性關系[45]。采用熒光法靈敏度要遠高于紫外分光光度法，且該法適用于微量樣品中酶活性的測定，但是由于早期熒光分光光度計價格昂貴未得到普及，國內(nèi)外文獻中有關用熒光法測定乳酸脫氫酶活性的報道極少，方法尚不夠成熟。

新鮮魚肉中乳酸脫氫酶的活性較高，但隨著冷藏時間的延長其活性明 顯下降，呈現(xiàn)負相關（P≤0.01）。此外，宰后魚肉經(jīng)過冷藏后TBA值明顯升高，與乳酸脫氫酶活性明顯下降存在顯著相關性[7]。

4 骨骼肌蛋白降解的相關酶——鈣激活蛋白酶和溶酶體組織蛋白酶

4.1 鈣激活蛋白酶

4.1.1 鈣激活蛋白酶及其與宰后魚肉硬度等品質(zhì)的關系

鈣激活蛋白酶（又稱鈣激活因子、鈣激活酶、依鈣蛋白酶、鈣激活中性蛋白酶）[46]是一個半胱氨酸蛋白酶家族。至今已鑒定出14 個成員，在骨骼肌中主要由μ-鈣蛋白酶、m-鈣蛋白酶、鈣蛋白酶3（calpain 3、p94）、鈣蛋白酶抑制蛋白和鈣蛋白酶激活蛋白組成[5]。除激活時需要的鈣離子濃度不同以及結(jié)構略有差異外，μ-鈣蛋白酶和m-鈣蛋白酶類似，均由80 ku的具有催化活性的大亞基和30 ku的具有調(diào)節(jié)活性的小亞基構成。被Ca2+激活的機理大致分為以下4 個過程：大、小亞基發(fā)生分離；30 ku的小亞基自溶降解為17 ku；80 ku的大亞基自溶經(jīng)78 ku再降解為76 ku；酶構象發(fā)生變化而表現(xiàn)水解蛋白的活性。鈣激活蛋白酶作為一個酶原，自溶是其發(fā)揮降解作用的前提，活性下降是其發(fā)揮降解作用的標志。p94由于在提取時不穩(wěn)定，極易失去活性，因此目前還沒證實它與魚肉硬度的關系，但是它能結(jié)合到肌聯(lián)蛋白的N2線位點上，此位點的水解與肉的嫩化有關，并且有跡象表明它和肌纖維代謝活性有關，因此近年來引起了肉類學家的廣泛關注[47]。鈣蛋白酶抑制蛋白是細胞內(nèi)高效專一性抑制鈣激活蛋白酶活性的蛋白質(zhì)，它能識別鈣激活蛋白酶與鈣結(jié)合引起的構象變化，并與之特異性結(jié)合，保證對底物只進行局部特定位點的水解，這種抑制作用不受pH值影響。鈣蛋白酶激活蛋白作為另一種鈣激活蛋白酶調(diào)節(jié)因子，是一個分子質(zhì)量為30 ku的熱穩(wěn)定二聚體。它能顯著提高鈣激活蛋白酶的活性并減弱鈣蛋白酶抑制蛋白的作用。目前發(fā)現(xiàn)有2 種類型，一種是UK114，是μ-鈣蛋白酶的激活因子；另 一種是?；o酶A結(jié)合蛋白（acyl-CoA-binding protein，ACBP），是m-鈣蛋白酶的激活因子[46]。目前有關鈣蛋白酶激活蛋白的研究正在興起，國內(nèi)相關研究較少[1]。

鈣激活蛋白酶可能參與肌原纖維解裝配成肌絲的過程，控制骨架蛋白和肌原纖維蛋白的降解，是蛋白質(zhì)水解過程的限速步驟[48]。僵直后的成熟嫩化過程最重要的是Z盤的崩解，已經(jīng)證實蛋白水解酶特別是鈣激活蛋白酶參與了這一過程，它通過肌聯(lián)蛋白的斷裂引發(fā)Z線的斷裂，弱化了肌聯(lián)蛋白與α-輔肌動蛋白之間的相互作用，并且導致了完整的α-輔肌動蛋白從肌纖維結(jié)構中釋放。宰后魚肉中鈣激活蛋白酶活性受到多種因素的影響，如pH值下降速率、最終pH值、貯藏溫度、初始鈣蛋白酶抑制蛋白含量等[17]。

魚體宰后，隨著ATP的消耗和pH值下降，細胞膜的完整性破壞，釋放肌質(zhì)網(wǎng)肌小泡內(nèi)積蓄的鈣離子，鈣激活蛋白酶被活化而后發(fā)生自溶[49]。自溶能降低鈣激活蛋白酶對Ca2+的依賴性[50]。一些研究表明是μ-鈣蛋白酶而不是m-鈣蛋白酶影響死后貯藏過程中魚肉的硬度，因為研究結(jié)果顯示：在貯藏過程中μ-鈣蛋白酶發(fā)生了快速的自溶，而m-鈣蛋白酶卻相當穩(wěn)定[51]。

目前，一些研究人員對關于鈣激活蛋白酶是造成肌肉嫩化的主要蛋白水解酶存在以下幾點爭論：鈣蛋白酶抑制蛋白的含量是μ-鈣蛋白酶的兩倍，且魚體中的鈣離子濃度達不到理論上激活鈣激活蛋白酶所需的濃度，那么鈣激活蛋白酶是如何被激活的，且被激活后又由于自溶作用而很快失活了，其如何發(fā)揮水解作用；鈣激活蛋白酶正調(diào)節(jié)因子（鈣蛋白酶激活蛋白）是如何調(diào)控鈣激活蛋白酶活性的；p94的作用機理尚不明確[52]。也有部分研究者提出游離鈣離子自身能通過非酶作用參與肌肉嫩化，如Shimada等[53]指出鈣離子通過與磷脂直接結(jié)合參與Z盤的崩解，但是他們也沒有完全排除一種未知蛋白酶參與這種限制性蛋白水解的可能性。

然而大量的研究表明，只能由鈣激活蛋白酶系提供肌絲降解所需要的特殊剪切，但它可能參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)代謝，而非整個蛋白降解過程的直接參與者。另外，有研究指出，當有鈣激活蛋白酶抑制劑或乙二醇二乙醚二胺四乙酸（ethylene glycol tetraacetic acid，EGTA）等鈣離子絡合劑存在時，仍然有部分肌原纖維蛋白可以發(fā)生降解。這些都可以推測除了鈣激活蛋白酶系外還可能存在其他的內(nèi)源性酶類參與了肌肉嫩化過程[54]。鈣激活蛋白酶可能通過對肌原纖維蛋白進行局部的特異性降解而對其結(jié)構和功能進行調(diào)控，即首先攻擊肌原纖維的肌節(jié)部位，釋放肌絲使降解為小片段，然后被溶酶體捕獲并進一步降解。

4.1.2 鈣激活蛋白酶的分離純化及活性測定

目前鈣激活蛋白酶有兩種較為普遍的分離純化方法，即疏水層析法和離子交換層析法[46]。有報道指出，通過疏水層析法和隨后進行的陰離子交換層析法能成功地將鈣蛋白酶抑制蛋白從鈣激活蛋白酶中分離出來，同時分離出μ-鈣蛋白酶和m-鈣蛋白酶兩種形式[55]。國外也有文獻報道，可采用快速蛋白液相層析法（fast protein liquid chromatography，F(xiàn)PLC）用DEAE柱分離純化鈣激活蛋白酶[17]；另外也有研究指出可采用DEAE-Sepharose F. F.代替DEAE-Sephacel來縮短洗脫時間，達到更快速的μ-鈣蛋白酶、m-鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白分離[56]。

鈣激活蛋白酶活性測定可通過酪蛋白酶譜法，另外此法還可以用于分離發(fā)生自溶和未自溶的酶[57]。也可采用酪蛋白作為底物，設置加入氯化鈣溶液或乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic acid，EGTA）鈣離子絡合劑兩個實驗組，再通過紫外分光光度法在278 nm波長處 測定吸光度變化值或考馬斯亮藍法在595 nm波長處測定吸光度變化值來測定酪蛋白含量進而間接測定鈣激活蛋白酶的活性[58]，此法操作簡單、成本低，但靈敏度相對較低。另外，也可使用琥珀酰-亮氨酸-酪氨酸-7-酰胺基-4-甲基香豆素（N-succinyl-leucine-tyrosine-7-amino-4-methylcoumarin，Suc-Leu-Tyr-AMC）作為底物，加入｛3-[3-（膽酰胺丙基）-二乙胺]-1-丙磺酸｝（ 3-[3-(cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulphonate，CHAPS），在355 nm的激發(fā)波長和460 nm的發(fā)射波長下通過測定酶水解上述底物釋放出的酰氨甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）的熒光值來測定鈣蛋白酶活性[59]，熒光法的靈敏度高于紫外分光光度法，且適用于微量樣品的測定，但相比于酪蛋白，此法使用的底物Suc-Leu-Tyr-AMC并不是鈣激活蛋白酶的良好底物[60]。

鈣激活蛋白酶在新鮮狀態(tài)時具有較高活性，測得的黑鱸白肉中的鈣激活蛋白酶酶活力為（1308±261）FU/（min·g），鈣蛋白酶抑制蛋白酶活力為（22444±4021）FU/（min·g），鈣蛋白酶抑制蛋白與鈣激活蛋白酶活性比率為17.2[13]。有研究結(jié)果顯示：隨著貯藏時間的延長鈣激活蛋白酶活性逐漸下降，當牦牛肉成熟第8天時其活性僅為剛屠宰時的27%；另外，發(fā)現(xiàn)反映肌原纖維蛋白降解和結(jié)構破壞程度的肌原纖維小片化指數(shù)與鈣激活蛋白酶活性呈顯著性相關（P＜0.01）[14]。在鈣激活蛋白酶系中，μ-鈣蛋白酶活性隨貯藏時間下降最顯著，鈣蛋白酶抑制蛋白次之，而m-鈣蛋白酶活性變化最不顯著[46]。

4.2 溶酶體組織蛋白酶

4.2.1 溶酶體組織蛋白酶及其與宰后魚肉硬度等品質(zhì)的關系

已知的溶酶體組織蛋白酶大約有16 種，根據(jù)作用位點的不同可分為4 類：半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、金屬酵素蛋白酶[61]。目前已從骨骼肌中分離到8 種組織蛋白酶，它們是A、B1、B2（溶酶體羧肽酶B）、C、D、E、H和L[56]。其中，B、D、H、L是肌肉中主要的組織蛋白酶。除了組織蛋白酶D外，其余3 種都是半胱氨酸內(nèi)切酶。組織蛋白酶大多屬于酸性蛋白酶，組織蛋白酶B、D、H、L的適宜pH值范圍分別為3.0～6.0、2.8～4.0、5.0～7.0、3.0～6.0，但在水解時卻表現(xiàn)出更寬的活性范圍[62]。

組織蛋白酶B是一個分子質(zhì)量為30 ku的雙葉形硫醇蛋白酶，兼有內(nèi)肽酶及羧肽酶活性[63]，通過左葉的半胱氨酸殘基（C29）和右葉的組氨酸殘基（H199）的相互作用催化肽鍵的斷裂[64]。

組織蛋白酶D是一種天冬氨酸蛋白酶，分子質(zhì)量為43～53 ku，是一種酸性糖蛋白，在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中作為酶原被合成。它是唯一能在pH6以下有活性且不需要還原環(huán)境的溶酶體酶。單獨的組織蛋白酶D水解活性較弱，但與組織蛋白酶A一起能顯著提高其水解作用，推測可能是組織蛋白酶A能進一步水解組織蛋白酶D降解后的肽鏈產(chǎn)物[65-66]。有研究[67]指出組織蛋白酶D在肌原纖維降解和肌肉的嫩化中起到了重要作用，并且在宰后肉的解僵成熟過程中產(chǎn)生了風味物質(zhì)。

組織蛋白酶H的分子質(zhì)量為26～28 ku，兼有硫醇內(nèi)切酶和氨肽酶活性。它能以內(nèi)肽酶的作用方式水解魚精蛋白，以氨肽酶的作用方式水解三肽和四肽。目前關于魚類中組織蛋白酶H降解肌原纖維蛋白的研究報道較少，這可能是因為酶粗提液中組織蛋白酶H的內(nèi)肽酶活性遠低于組織蛋白酶B和L；另外酶粗提液中存在的部分氨肽酶也使得其活性難于準確測定[68]。

組織蛋白酶L和組織蛋白酶B分子質(zhì)量類似且也屬于硫醇蛋白酶[69]。目前的研究表明組織蛋白酶L降解肌球蛋白的活性比B高10 倍，組織蛋白酶H比B高5 倍，組織蛋白酶D比B高2～3 倍。Matsukura等[70]發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶L對肌動蛋白的降解比肌球蛋白慢。近來，發(fā)現(xiàn)大西洋鮭魚魚片的硬度與組織蛋白酶L的活性呈現(xiàn)顯著的負相關[51]。有報道[71-72]指出由于組織蛋白酶L對三文魚肌肉結(jié)構蛋白的水解多于組織蛋白酶B，并且由于其底物水解的專一性，指出組織蛋白酶L是最可能參與肌肉軟化過程中的酶。

組織蛋白酶B、H、L在活的有機體內(nèi)被半胱氨酸蛋白酶抑制劑調(diào)節(jié)控制[73]，通常活性不高，但是在死后肌肉的冷藏和解凍過程中會釋放出來[5]。組織蛋白酶在體內(nèi)主要以酶原形式存在，其激活是通過蛋白水解酶切除部分肽鏈實現(xiàn)的[10]。不同的組織蛋白酶具有不同的水解特異性。組織蛋白酶B水解肌球蛋白重鏈、肌鈣蛋白T，并且會緩慢降解肌鈣蛋白I和原肌球蛋白；組織蛋白酶D能降解肌球蛋白、肌動蛋白、肌聯(lián)蛋白；組織蛋白酶H主要降解肌鈣蛋白T；組織蛋白酶L降解除了肌鈣蛋白C和原肌球蛋白以外的大部分肌原纖維蛋白[74]。

目前，一些學者認為肌肉在宰后貯藏過程中蛋白質(zhì)的降解是分步進行的，首先鈣激活蛋白酶進行初步降解，然后溶酶體組織蛋白酶進一步降解，兩者協(xié)同完成肉的嫩化[10]。

4.2.2 溶酶體組織蛋白酶的分離純化及活性測定

溶酶體組織蛋白酶分離純化的關鍵就是要除去細胞中的鈣激活蛋白酶，一般采用親和層析法提取。文獻指出還可經(jīng)粗酶液提取、酸處理、硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose F. F. 離子交換層析和Sephacryl S-100凝膠過濾層析等步驟進行其分離純化[68]。

國內(nèi)外測定溶酶體組織蛋白酶活性的方法大致相似，僅在底物的選擇和某些操作過程細節(jié)方面存在一些差異。其中組織蛋白酶B、B+L、H的活性大多采用靈敏度較高的熒光分析法，可分別以N-芐酯基-精氨酸-精氨酸-7-酰胺基-4-甲基香豆素（Z-arginine-arginine-7-amino-4-methylcoumarin，Z-RR-AMC）、N-芐酯基-苯丙氨酸-精氨酸-7-酰胺基-4-甲基香豆素（Z-phenylalaninearginine-7-amino-4-methylcoumarin，Z-FR-AMC）、N-芐酯基-精氨酸-7-酰胺基-4-甲基香豆素（L-arginine-7-amino-4-methylcoumarin，R-AMC）作為底物，在37 ℃和pH值分別為6.0、6.0、6.8的條件下反應，在355 nm的激發(fā)波長和460 nm的發(fā)射波長下通過測定酶水解上述底物釋放出AMC產(chǎn)物的熒光值來測定酶的活力[62,75-76]。其中，在測定組織蛋白酶H的活性時，由于氨肽酶的影響，需向反應體系中加入半胱氨酸蛋白酶的專一不可逆抑制劑——反式環(huán)琥珀酰-亮氨酰氨-胍基丁酮（trans ring succinyl-bright ammonia amido-guanidine butanone，E-64），通過測定降低的活性間接求出組織蛋白酶H的活性。也有報道指出可以采用偶氮酪蛋白的變異型（變體）作為底物測定組織蛋白酶L的活性，而且此底物目前也廣泛使用，但從靈敏度、安全性、方便性的角度分析，目前為止認為最適宜的半胱氨酸蛋白酶底物釋放基團（離去基團）是酰氨甲基香豆素[77]。組織蛋白酶D活性的測定可在酸性緩沖液中使用酸變性的牛血紅蛋白作為底物，以添加胃蛋白酶抑制劑（抑肽素）A來抑制組織蛋白酶D作為對照或者先添加終止劑三氯乙酸再加入底物作為對照，通過測定在280nm波長處的吸光度來計算酶活力單位[78]。提取物中的蛋白濃度通過考馬斯亮藍法用牛血清白蛋白作標準進行測定。

組織蛋白酶活性在宰后魚肉貯藏前期活性相對較低，有研究報道：宰后黑鱸白肉中組織蛋白酶D的活性為（1.8±0.21）A295nm/（min·g），組織蛋白酶H的活性為（170±39）FU/（min·g），組織蛋白酶B的活性為（2168±79）FU/（min·g），組織蛋白酶L的活性為9655 FU/（min·g）[13]。但隨著貯藏時間的延長，當魚肉的pH值下降至一定程度時，組織蛋白酶從溶酶體中釋放，其活性逐漸增大，并與鈣激活蛋白酶活性呈顯著性負相關（P＜0.05），同時，也與肌原纖維小片化指數(shù)呈顯著性相關（P＜0.05）[14]。

5 展 望

目前，從結(jié)構的變化判斷，上述4 種酶系統(tǒng)沒有一種單獨的酶系統(tǒng)能全面解釋宰后魚肉在低溫貯藏過程中所發(fā)生的所有能量代謝和品質(zhì)變化，推測可能是這些肌肉酶與其他的相關環(huán)境因素的共同協(xié)同作用。雖然國內(nèi)外的一些報道指出了鈣激活蛋白酶和溶酶體組織蛋白酶等肌肉酶在豬肉、牛肉等哺乳動物宰后肌肉的嫩化方面起到了關鍵作用，但是對宰后魚肉的品質(zhì)影響方面的研究還相對較少，相關的作用機理仍然不太清楚，目前仍存在有關這幾種肌肉酶與宰后魚肉品質(zhì)相關性的一些爭議。

關于影響宰后肌肉品質(zhì)的組織蛋白酶理論以及后期的鈣激活蛋白酶理論乃至目前的鈣離子單純誘導降解肌原纖維蛋白的爭論在國內(nèi)外研究得較多，但隨著宰后肌肉pH值下降到一定程度，鈣激活蛋白酶的活性基本消失，然而低的pH值有利于溶酶體膜的破裂從而釋放出組織蛋白酶進入肌原纖維結(jié)構中發(fā)揮水解酶作用，且其活性一直能被檢測得到，因此有必要深入研究鈣激活蛋白酶和組織蛋白酶的協(xié)同增效作用，比較二者在宰后不同貯藏時期各自的活性變化及其品質(zhì)相關性分析進而確定在整個貯藏期間內(nèi)兩者的交互作用。

另外，國內(nèi)雖有大量文獻報道酶活性的測定方法，但方法卻較為單一，并且在提取蛋白酶過程中導致的酶部分活性的喪失也難以反映肌肉中蛋白酶的真實活性，因此，加大對肌肉酶活性測定方法的探究以及保證提取時酶活性的最大程度保留將為宰后魚肉品質(zhì)酶學方法的建立提供有力的支撐。

對宰后魚肉在低溫貯藏過程中的肌肉酶進行更深入的研究從而形成更完善的理論體系有著廣泛的應用前景。內(nèi)源性蛋白水解酶理論體系的建立將對宰后魚肉品質(zhì)評價模型和貨架期保藏預測模型的構建、魚肉宰前的品質(zhì)分級以及利用基因工程技術進行品種改良等產(chǎn)生重要的意義。

[1] 梅承君, 龐輝, 康相濤, 等. 鈣蛋白酶系統(tǒng)研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2006, 34(22): 5774-5776.

[2] BENJAKUL S, SUTTHIPAN N. Muscle changes in hard and soft shell crabs during frozen storage[J]. LWT-Food Science and Technology, 2009, 42(3): 723-729.

[3] 周光宏, 李春保, 徐幸蓮. 肉類食用品質(zhì)評價方法研究進展[J]. 中國科技論文在線, 2007, 2(2): 75-82.

[4] LISBETH H, TURID R. Iced storage of Atlantic salmon (Salmo salar): effects on endogenous enzymes and their impact on muscle proteins and texture[J]. Food Chemistry, 2004, 87(1): 31-41.

[5] CAROLINE M K, PAUL L S, RONALD G B, et al. Tenderness: an enzymatic view[J]. Meat Science, 2010, 84(2): 248-256.

[6] 常海軍, 徐幸蓮, 周光宏. 肌內(nèi)結(jié)締組織與肉嫩度關系研究[J]. 肉類研究, 2009, 23(7): 9-14.

[7] NAMBUDIRI D D, GOPAKUMAR K. ATPase and lactate dehydrogenase activities in frozen stored fish muscle as indices of cold storage deterioration[J]. Journal of Food Science, 1992, 57(1): 72-76.

[8] 王勇, 李莉. 不同海拔地區(qū)牦牛組織線粒體LDH活性測定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2008, 36(33): 14536-14537.

[9] 李偉, 譚妮. 病原菌感染對鯽魚乳酸脫氫酶(LDH)活性的影響[J]. 安徽農(nóng)學通報, 2009, 15(12): 25-26.

[10] 黃明, 黃峰, 黃繼超, 等. 內(nèi)源性蛋白酶對宰后肌肉嫩化機制研究進展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2011, 44(15): 3214-3222.

[11] OCANO-HIGUERA V M, MARQUEZ-RIOS E, CANIZALESDAVILA M, et al. Postmortem changes in cazon f sh muscle stored on ice[J]. Food Chemistry, 2009, 116(4): 933-938.

[12] 倪莉, 郭靜科, 劉志云, 等. 肌纖維在燕皮形成過程中的聚集過程及ATP酶生化特性研究[J]. 中國食品學報, 2007, 7(6): 21-26.

[13] ROMUALD C, CHRISTINE D L, MARIE L A, et al. Calpain and cathepsin activities in post mortem fish and meat muscles[J]. Food Chemistry, 2007, 101(4): 1474-1479.

[14] 田甲春, 韓玲, 劉昕, 等. 牦牛肉宰后成熟機理與肉用品質(zhì)研究[J].農(nóng)業(yè)機械學報, 2012, 43(12): 146-150.

[15] 勵建榮, 李婷婷, 李學鵬. 水產(chǎn)品鮮度品質(zhì)評價方法研究進展[J]. 北京工商大學學報: 自然科學版, 2010, 28(6): 1-8.

[16] LISBETH H, TURID R. Effects of temperature abuse on textural properties and proteolytic activities during post mortem iced storage of farmed Atlantic cod (Gadus morhua)[J]. Food Chemistry, 2007, 104(4): 1687-1697.

[17] FIDEL T, MONICA F. The use of muscle enzymes as predictors of pork meat quality[J]. Food Chemistry, 2000, 69(4): 387-395.

[18] 張玉, 張建明, 劉海濤, 等. 達里諾爾湖和崗更湖瓦氏雅羅魚Na+, K+-ATP酶活性的研究[C]//第三屆全國現(xiàn)代生態(tài)漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展交流研討會. 成都: 中國水利技術信息中心, 2011: 56-60.

[19] 劉信勇, 朱琳, 黃碧捷, 等. 多壁碳納米管對斑馬魚體組織內(nèi)酶活性的影響[J]. 環(huán)境科學研究, 2009, 22(7): 838-842.

[20] 閆建國, 汝少國, 邴欣, 等. 久效磷對黃鱔過氧化氫酶和Na+, K+-ATP酶活性的影響[J]. 環(huán)境科學研究, 2006, 19(3): 96-100.

[21] WATABE S, USHIO H, IWAMOTO M, et al. Temperature-dependency of rigor-mortis of f sh muscle: myof brillar Mg2+-ATPcase activity and Ca2+uptake by sarcoplasmic reticulum[J]. Food Science, 1989, 54: 1107-1115.

[22] 楊文鴿, 薛長湖, 徐大倫, 等. 大黃魚冰藏期間ATP關聯(lián)物含量變化及其鮮度評價[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報, 2007, 23(6): 217-222.

[23] 黃曉榮, 章龍珍, 莊平, 等. 超低溫冷凍對長鰭籃子魚精子中幾種酶活性的影響[J]. 海洋科學, 2009, 33(7): 16-22.

[24] BENJAKUL S, VISESSANGUAN W, THONGKAEW C, et al. Effect of frozen storage on chemical and gel-forming properties of fish commonly used for surimi production in Thailand[J]. Food Hydrocolloids, 2005, 19(2): 197-207.

[25] BENJAKUL S, VISESSANGUAN W, THONGKAEW C, et al. Comparative study on physicochemical changes of muscle proteins from some tropical fish during frozen storage[J]. Food Research International, 2003, 36(8): 787-795.

[26] 張貴勝, 李莉, 常建軍, 等. 不同發(fā)育期大通牦牛心肌、骨骼肌線粒體ATP酶活性的測定[J]. 動物醫(yī)學進展, 2012, 33(8): 112-114.

[27] 黃征征, 黃旭雄, 嚴佳琦, 等. 生長階段及溫度對微藻細胞總ATP酶活性的影響[J]. 海洋漁業(yè), 2011, 33(2): 181-186.

[28] 錢迅. 質(zhì)膜鈣鎂ATP酶的分離、純化和重建及其在高血壓狀態(tài)下功能變化和機制的研究[D]. 北京: 中國協(xié)和醫(yī)科大學, 1997.

[29] 屠亞平, 徐紅. 親和層析純化肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶[J]. 生物化學與生物物理進展, 1995, 22(4): 345-349.

[30] ANDREU J M, MUNOZ E. Micrococcus lysodeikticus ATPase: purification by preparative gel electrophoresis and subunit structure studied by urea and sodium dodecylsulfate gel electrophoresis[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 1975, 387(2): 228-233.

[31] SUSS K H, MALYAN A N. Isolation, purification and propertiesof coupling factor ATPase from Rhodopseudomonas palutris chromatophores[J]. Biochemie und Physiologie der Pflanzen, 1980, 175(6): 491-498.

[32] 周愛梅, 龔杰, 邢彩云, 等. 羅非魚與鳙魚魚糜蛋白在凍藏中的生化及凝膠特性變化[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學學報, 2005, 26(3): 103-107.

[33] 李莎, 李來好, 楊賢慶, 等. 羅非魚片在冷藏過程中的品質(zhì)變化研究[J].食品科學, 2010, 31(20): 444-447.

[34] HENRY T, FERGUSON A. Kinetic studies on the lactate dehydrogenase isozymes of the brown trout, Salmo trutta L.[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry, 1986, 85(2): 491-496.

[35] BEATTY E M, DOXEY D L. One and two dimensional isoelectric focusing of lactate dehydrogenase from the tissues of Ovis aries[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry, 1983, 76(2): 271-275.

[36] SONIA H T, MARIA M O, EDUARDO L, et al. Lactate dehydrogenase isozymes in skeletal muscle of patients with chronic obstructive pulmonary disease[J]. Archivos de Bronconeumología: English Edition, 2009, 45(2): 75-80.

[37] 周靜. 乳酸脫氫酶的分離純化及其性質(zhì)的研究[J]. 赤峰學院學報:自然科學版, 2009, 25(9): 111-113.

[38] BOLOTINA I A, MARKOVICH D S, VOLKENSTEIN M V, et al. Investigation of the conformation of lactate dehydrogenase and of its catalytic activity[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -Enzymology, 1967, 132(2): 271-281.

[39] MARCHAT L, LOISEAU P M, PETEK F. Purification and characterization of lactate dehydrogenase isoenzymes 1 and 2 from Molinema dessetae (Nematoda: Filarioidea)[J]. Parasitol Research, 1996, 82: 672-680.

[40] 金黎明, 張樂, 蔣本國, 等. 羊心肌乳酸脫氫酶的純化及性質(zhì)研究[J].大連民族學院學報, 2006(1): 20-23.

[41] 石軒峰, 謝慧, 楊海麟, 等. 植物乳桿菌乳酸脫氫酶的分離純化工藝研究[J]. 河南工業(yè)大學學報: 自然科學版, 2005, 26(3): 49-53.

[42] 袁劍, 秦浩, 葛向陽, 等. 干酪乳桿菌L-乳酸脫氫酶在大腸桿菌中的表達、純化及酶學性質(zhì)[J]. 微生物學通報, 2011, 38(10): 1482-1487.

[43] EZZATOLLAH K, NAGHMEH S. Catalytic properties of three L-lactate dehydrogenases from saffron corms (Crocus sativus L.)[J]. Molecular Biology Reports, 2002, 29: 163-166.

[44] 習玲玲, 施清照. 電聚合修飾碳纖維電極及乳酸脫氫酶活性的測定[J].分析化學, 2001, 29(12): 1457-1460.

[45] 李喬婧, 李永生, 周朗, 等. 酶熒光毛細管分析法測定微量血清中乳酸脫氫酶活性[J]. 分析化學, 2012, 40(7): 1043-1047.

[46] 蘇永杰, 梁梓, 鄭玉才. 鈣蛋白酶在肉嫩化中的作用及其活性測定[J].西南民族大學學報: 自然科學版, 2006, 32(3): 564-567.

[47] 張英君, 陳有亮. 鈣激活蛋白酶在肉成熟中的作用機理[J]. 肉類工業(yè), 2000(8): 31-36.

[48] 葉鴿, 黃卉, 李來好, 等. 肌肉酶對宰后魚肉品質(zhì)影響的研究進展[J].食品工業(yè)科技, 2013, 34(7): 370-373; 377.

[49] 杜敏, 朱美君. 內(nèi)源蛋白酶與肉的嫩化[J]. 肉類研究, 1994(3): 13-14; 21. [50] 翟峰, 張勇, 朱宇旌. 鈣蛋白酶系統(tǒng)與肌肉增長及嫩度的相關性研究[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2007, 39(9): 35-37.

[51] GAARDER M ?, BAHUAUD D, VEISETH-KENT E, et al. Relevance of calpain and calpastatin activity for texture in superchilled and ice-stored Atlantic salmon (Salmo salar L.) fillets[J]. Food Chemistry, 2012, 132(1): 9-17.

[52] 金海麗, 許梓榮. 鈣蛋白酶系統(tǒng)與肌肉增長及嫩度的關系[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學報, 2002, 14(6): 354-359.

[53] SHIMADA K, AHN D H, TAKAHASHI K. Liberation of phospholipids from Z-disks of chicken skeletal muscle myofibrils by 0.1 mM calcium ions: weakening mechanism for Z-disks during postmortem aging of meat[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1998, 62(5): 919-926.

[54] CHRISTINE D L, VERONIQUE V B, JOELLE N, et al. Relative contribution of calpain and cathepsins to protein degradation in muscle of sea bass (Dicentrarchus labrax L.)[J]. Food Chemistry, 2004, 88(3): 389-395.

[55] O’HALLORAN G R, TROY D J, BUCKLEY D J, et al. The role of endogenous proteases in the tenderisation of fast glycolysing muscle[J]. Meat Science, 1997, 47(3/4): 187-210.

[56] MORTON J D, BICKERSTAFFE R, KENT M P, et al. Calpaincalpastatin and toughness in M. longissimus from electrically stimulated lamb and beef carcasses[J]. Meat Science, 1999, 52(1): 71-79.

[57] LUIGI P, PER E. The effect of temperature on the activity of μ-and m-calpain and calpastatin during post-mortem storage of porcine longissimus muscle[J]. Meat Science, 2012, 91(1): 50-55.

[58] 馬儷珍, 王永輝, 范三紅. 豬宰后肌肉中鈣激活蛋白酶活性變化的研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報, 2007, 23(2): 239-243.

[59] CHRISTINE D L, VERONIQUE V B, JOELLE N, et al. Proteolytic potential in white muscle of sea bass (Dicentrarchus labrax L.) during post mortem storage on ice: time-dependent changes in the activity of the components of the calpain system[J]. Food Chemistry, 2004, 84(3): 441-446.

[60] CHRISTINE L, VéRONIQUE V B, JO˙L N, et al. Milli-calpain from sea bass (Dicentrarchus labrax) white muscle: purification, characterization of its activity and activation in vitro[J]. Marine Biotechnology, 2002, 4: 51-62.

[61] CHEN Ling, SUN Li. Cathepsin B of Cynoglossus semilaevis: Identification, expression, and activity analysis[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 2012, 161(1): 54-59.

[62] 穆雪, 韓劍眾. 骨骼肌中組織蛋白酶[J]. 肉類研究, 2010, 24(5): 13-17.

[63] 于蕾, 朱蓓薇, 孫黎明, 等. 海參腸道組織蛋白酶B粗酶提取條件的優(yōu)化[J]. 大連工業(yè)大學學報, 2010, 29(6): 409-412.

[64] JOHN S M, DAVID J B. Cathepsin B[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 1997, 29(5): 715-720.

[65] 吳永沛. 組織蛋白酶與魚類自溶作用[J]. 海洋科學, 1990(1): 59-63.

[66] 陳琳, 唐瑋, 徐幸蓮, 等. 溶酶體中的組織蛋白酶及其在肌肉成熟中的作用[J]. 江西農(nóng)業(yè)學報, 2008, 20(2): 72-75.

[67] 李樹紅, 張楠, 劉歡, 等. 鰱魚背肌肌原纖維蛋白自溶與內(nèi)源組織蛋白酶B, L, H的關系[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學學報, 2004, 9(5): 71-75.

[68] 侯魯娜, 聶小華, 虞慧玲, 等. 鯉魚組織蛋白酶L的分離純化與酶學性質(zhì)研究[J]. 食品科技, 2011, 36(2): 9-12.

[69] 侯魯娜, 陳學云, 聶小華, 等. 魚糜凝膠劣化相關組織蛋白酶的研究進展[J]. 食品科技, 2010, 35(9): 164-167.

[70] MATSUKURA U, OKITANI A, NISHIMURO T, et al. Mode of degradation of myofibrillar proteins by an endogenous protease, cathepsin L[J]. Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Enzymology, 1981, 662(1): 41-47.

[71] YAMASHITA M, KONAGAYA S. Hydrolytic action of salmon cathepsins B and L to muscle structural proteins in respect of muscle softening[J]. Nippon Suisan Gakkaishi, 1991, 57(10): 1917-1922.

[72] LADRAT C, VERREZ-BAGNIS V, NOEL J, et al. in vitro proteolysis of myofibrillar and sarcoplasmic proteins of white muscle of sea bass (Dicentrarchus labrax L.): effects of cathepsins B, D and L[J]. Food Chemistry, 2003, 81(4): 517-525.

[73] JASON K, SHONISANI C T, TOMOHISA O, et al. Purification and partial characterization of ostrich skeletal muscle cathepsin D and its activity during meat maturation[J]. Meat Science, 2011, 87(3): 196-201.

[74] BECHET D, TASSA A, TAILLANDIER D, et al. Lysosomal proteolysis in skeletal muscle[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2005, 37(10): 2098-2114.

[75] 趙利, 劉建濤, 蘇偉, 等. 天然抑制組織蛋白酶B的生物活性肽[J]. 中國乳品工業(yè), 2006, 34(7): 50-52.

[76] THOMAS A R, GONDOZA H, HOFFMAN L C, et al. The roles of the proteasome, and cathepsins B, L, H and D, in ostrich meat tenderisation[J]. Meat Science, 2004, 67(1): 113-120.

[77] BARRETT A J, KIRSCHKE H. Cathepsin B, cathepsin H, and cathepsin L[J]. Methods in Enzymology, 1981, 80: 535-561.

[78] 袁素芬. 大骨節(jié)病患者軟骨中組織蛋白酶D的活性[J]. 中國地方病學雜志, 1989, 8(1): 7-9.

Enzymes Associated with Postmortem Energy Metabolism and Texture of Fish Muscle and Assays to Detect Them

SUN Lei-lei1,2, HUANG Hui1, LI Lai-hao1,*, YANG Xian-qing1, HAO Shu-xian1, CEN Jian-wei1, YANG Shao-ling1, ZHAO Yong-qiang1
(1. Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture, National Research and Development Center for Aquatic Product Processing, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China; 2. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

A series of physical, chemical and microbiological postmortem changes of f sh muscle may occur during lowtemperature storage. Studies have shown that postmortem energy metabolism and changes of texture in fish muscle are related to endogenous hydrolytic enzymes in the muscle. In this paper, we review the structural characteristics, separation, purif cation and activity assays of four types of muscle enzymes (i.e. ATPase and lactate dehydrogenase, associated with energy metabolism; and calpain and lysosomal cathepsin, associated with texture) This review is expected to provide useful guidelines for establishing an enzymatical method for postmortem energy metabolism and quality control of f sh.

f sh meat; muscle enzyme; energy metabolism; texture; enzyme activity

TS254.1

A

1002-6630（2014）11-0348-08

10.7506/spkx1002-6630-201411067

2013-07-17

廣州市珠江科技新星項目（2012J2200075）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項（2012TS22；2012YD01）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（羅非魚）產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（CARS-49）；國家自然科學基金面上項目（30671631）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201003055-06）；國家重大科技成果轉(zhuǎn)化項目（ZD-2013-345-3）

孫蕾蕾（1989—），女，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)品加工和質(zhì)量安全。E-mail：leilei.198966@163.com

*通信作者：李來好（1963—），男，研究員，博士，研究方向為水產(chǎn)品加工和質(zhì)量安全。E-mail：laihaoli@163.com