開(kāi)心果總黃酮預(yù)處理對(duì)急性肝損傷小鼠肝組織的保護(hù)作用及機(jī)制

依明·尕哈甫，麥爾旦·吐?tīng)栠d麥麥提，熱娜·卡斯木，韓南銀

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊830011；2北京大學(xué)藥學(xué)院)

肝損傷疾病發(fā)病率高、治療難度大，如果未得到及時(shí)治療，會(huì)進(jìn)一步誘導(dǎo)脂肪肝、肝硬化、肝纖維化甚至肝癌的發(fā)生。肝損傷是多因素參與的復(fù)雜病理過(guò)程，研究表明，氧化應(yīng)激和炎癥在肝細(xì)胞病變過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。然而，目前關(guān)于肝損傷的發(fā)病機(jī)制還未全面闡明，尚缺乏特效的治療藥物。開(kāi)心果中含有的黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)具有多種生物活性的天然產(chǎn)物，具有抗氧化、抗炎、保肝等功能[2]。2017年12月～2018年3月，我們采用四氯化碳(CCl4)建立大鼠急性肝損傷模型，觀察開(kāi)心果總黃酮對(duì)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)以及炎癥因子白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、干擾素γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的影響，并測(cè)定肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、還原型谷胱甘肽(GSH)等氧化應(yīng)激指標(biāo)和肝臟組織的病理學(xué)變化，探討開(kāi)心果總黃酮抗肝損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器 SPF級(jí)健康昆明種小鼠50只，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。開(kāi)心果購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院，取開(kāi)心果粉末經(jīng)10倍量的80%乙醇回流提取3次并減壓濃縮，濃縮液經(jīng)D101型大孔吸附樹(shù)脂洗脫純化，選取70%乙醇洗脫液并濃縮至浸膏，再經(jīng)冷凍干燥成粉末，測(cè)得總黃酮含量為63.29%。將總黃酮干燥粉末用0.3%的羥甲基纖維素鈉混勻。CCl4(天津永晟化學(xué)試劑廠)；總蛋白定量(BCA法)、SOD、MDA、NO和GSH檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α檢測(cè)試劑盒(博士德生物有限公司)。BS-450型全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療有限公司)；UV-754型紫外-可見(jiàn)分光光度儀(上海菁華科技儀器有限公司)；RT-6100型酶標(biāo)儀(深圳雷社生命科學(xué)有限公司)；TGL-16M型冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；HH型恒溫水浴鍋(金壇科析儀器有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組與干預(yù) 將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組及開(kāi)心果總黃酮低、中、高劑量組各10只。開(kāi)心果總黃酮低、中、高劑量組分別給予100、200、400 mg/kg開(kāi)心果總黃酮灌胃，正常組和模型組給予等量蒸餾水灌胃，均1次/d，連續(xù)7 d。

1.3 肝損傷模型的建立 末次給藥1 h后，正常組給予花生油溶液0.1 mL/10 g體質(zhì)量腹腔注射，模型組和開(kāi)心果總黃酮組小鼠均以0.1%的CCl4花生油溶液(0.1 mL/10 g體質(zhì)量)腹腔注射建立急性肝損傷模型，禁食不禁水繼續(xù)飼養(yǎng)8 h。

1.4 血清ALT、AST、IL-6、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平檢測(cè) 造模后8 h，小鼠摘眼球取血1.5 mL，3 000 r/min離心10 min，取血清。使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST水平，酶標(biāo)儀檢測(cè)小鼠血清IL-6、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5 肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)測(cè)算 經(jīng)頸椎脫臼處死小鼠，摘取肝臟和脾臟并稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器濕重(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)。

1.6 肝組織病理學(xué)檢查 剖取小鼠肝臟左葉距邊緣0.5 cm處的組織置于10%甲醛溶液中固定，經(jīng)HE染色法制備切片，在400倍光鏡下觀察小鼠肝組織病理學(xué)變化。

1.7 肝組織勻漿上清液中SOD、MDA、NO、GSH水平檢測(cè) 取0.5 g小鼠肝臟組織，置于冰生理鹽水中冷藏，冰浴研磨成組織勻漿，3000 r/min離心10 min，取上清液。紫外分光光度法檢測(cè)SOD、MDA、NO、GSH水平，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2 結(jié)果

2.1 各組血清ALT、AST水平比較 與正常組比較，模型組血清ALT、AST水平均升高(P均<0.01)。與模型組比較，開(kāi)心果總黃酮中、高劑量組血清ALT、AST水平均降低(P均<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組血清ALT、AST水平比較

注：與正常組比較，#P<0.01；與模型組比較，*P<0.01。

2.2 各組血清IL-6、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平比較 與正常組比較，模型組血清IL-6、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平升高(P均<0.05)。與模型組比較，開(kāi)心果總黃酮中、高劑量組血清IL-6、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平降低(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組血清IL-6、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平比較

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.3 各組肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)比較 與正常組比較，模型組肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)均升高(P均<0.05)。與模型組比較，開(kāi)心果總黃酮中、高劑量組肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)均降低(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)比較

注：與正常組比較，#P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，△P<0.01。

2.4 各組肝組織病理檢查結(jié)果比較 正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生，無(wú)明顯變性壞死。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)和肝細(xì)胞排列紊亂，肝細(xì)胞水腫，部分肝細(xì)胞壞死或氣球樣改變，細(xì)胞質(zhì)變疏松，肝細(xì)胞脂肪變性多見(jiàn)，可見(jiàn)碎片狀和點(diǎn)狀壞死，存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比，開(kāi)心果總黃酮組尤其是中、高劑量組，肝細(xì)胞水腫減輕，肝細(xì)胞壞死和脂肪變性減少，偶見(jiàn)浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞，肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，病理組織顯著改善。

2.5 各組肝組織勻漿上清液中SOD、MDA、NO、GSH水平比較 與正常組比較，模型組肝組織中MDA、NO水平升高，SOD、GSH水平降低(P均<0.05)。與模型組比較，開(kāi)心果總黃酮中、高劑量組血清MDA、NO水平降低，SOD、GSH水平升高(P均<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組肝組織勻漿上清液中SOD、MDA、NO、GSH水平比較

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3 討論

肝臟作為體內(nèi)重要的代謝和解毒器官，對(duì)化學(xué)物質(zhì)、藥物、免疫性疾病、乙醇等損傷因素非常敏感，肝損傷可表現(xiàn)為肝組織壞死、肝脂肪化、肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌[3]。肝損傷的治療原則為維護(hù)肝細(xì)胞功能的穩(wěn)定性，減少肝細(xì)胞組織炎癥的程度，促進(jìn)損傷組織的修復(fù)等[4]。目前治療肝損傷的藥物很多，如抗炎保肝類(lèi)、修復(fù)肝細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)類(lèi)、解毒保肝類(lèi)、抗肝纖維化類(lèi)、利膽保肝類(lèi)等。目前對(duì)肝損傷的防治仍是一個(gè)重要課題，通過(guò)實(shí)驗(yàn)性肝損傷動(dòng)物模型篩選治療肝損傷藥物，探討其作用機(jī)制，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。肝損傷過(guò)程大多與氧化應(yīng)激和免疫有關(guān)，化學(xué)物質(zhì)、藥物、乙醇等能直接或間接誘導(dǎo)肝細(xì)胞生物膜系統(tǒng)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，干擾細(xì)胞內(nèi)的能量代謝，活化細(xì)胞死亡程序等，最終以轉(zhuǎn)氨酶升高為表現(xiàn)形成不同程度的肝功能失常[5]。CCl4可導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞肝細(xì)胞生物膜結(jié)構(gòu)的完整性，造成肝細(xì)胞損傷壞死，致使肝細(xì)胞內(nèi)的兩種轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST大量溢出并進(jìn)入血液，血漿ALT、AST水平升高[6]。此外，產(chǎn)生的過(guò)多的自由基將會(huì)耗竭SOD、GSH而使其減少[7]，而脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA和NO濃度會(huì)隨著肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的損傷而顯著提高[8]。肝損傷過(guò)程存在不同程度的肝臟炎癥，并導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ等的釋放增加[9]。近年來(lái)，中醫(yī)藥在治療肝損傷研究中表現(xiàn)出了穩(wěn)定的療效、較少的不良反應(yīng)等優(yōu)勢(shì)，特別是中藥中含有的黃酮類(lèi)化合物可以通過(guò)抗炎、提高肝組織抗氧化水平、消除自由基等作用保護(hù)肝臟[10]。

開(kāi)心果是漆樹(shù)科植物阿月渾子的果實(shí)或種子，是日常生活中常食用的一種干果，同時(shí)也作為中藥民族藥使用。據(jù)維吾爾醫(yī)學(xué)典籍記載，開(kāi)心果具有開(kāi)通肝阻作用，主治肝臟有阻[11]。藥理學(xué)研究顯示，開(kāi)心果具有抗炎和抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用[12]。開(kāi)心果總黃酮中含有柚皮素、大豆苷元、染料木素、槲皮素、山柰酚、芹菜素和木犀草素等黃酮類(lèi)成分[13]，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，其中的部分黃酮類(lèi)化合物具有保肝作用[14，15]。本研究通過(guò)觀察開(kāi)心果總黃酮防治肝損傷的作用，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)開(kāi)心果中具有保肝作用的有效成分提供理論依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，給予開(kāi)心果總黃酮預(yù)處理后，肝損傷小鼠血清ALT、AST水平降低，ALT和AST都屬于轉(zhuǎn)氨酶，轉(zhuǎn)氨酶是人體代謝過(guò)程中必不可少的“催化劑”，主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)，在肝細(xì)胞發(fā)生炎癥、壞死、中毒等損傷時(shí)水平會(huì)升高，經(jīng)開(kāi)心果總黃酮給藥治療后，小鼠血清ALT和AST水平下降，說(shuō)明開(kāi)心果總黃酮抑制了轉(zhuǎn)氨酶升高，肝損傷在逐漸恢復(fù)。開(kāi)心果總黃酮各劑量組SOD、GSH均升高且NO、MDA均降低，顯示了開(kāi)心果總黃酮的抗氧化保肝作用；同時(shí)開(kāi)心果總黃酮中、高劑量組血清IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ的炎性細(xì)胞因子水平顯著下降，說(shuō)明開(kāi)心果總黃酮通過(guò)下調(diào)炎癥反應(yīng)作用來(lái)抑制炎癥因子的產(chǎn)生，減緩對(duì)肝臟的毒性，減慢肝細(xì)胞壞死，從而起到對(duì)肝臟的保護(hù)作用。此外，給藥后肝損傷小鼠的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)均下降，小鼠肝臟的病理?yè)p傷程度得到顯著改善，提示臟器充血、水腫、壞死等現(xiàn)象得到了糾正。

綜上所述，開(kāi)心果總黃酮對(duì)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是抑制肝臟組織中自由基脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，保護(hù)肝細(xì)胞膜的完整性，并降低血清ALT、AST水平，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，抑制炎癥因子釋放，減輕炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮抗炎和保肝的功效。