β-地中海貧血患者82例基因型與臨床表型分析

翟英超 吳潔

571434海南博鰲一齡生命養(yǎng)護(hù)中心檢驗(yàn)科，海南瓊海1

570100海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，海南海口2

β-地中海貧血屬于一種單基因遺傳疾病，在全世界具有較高的發(fā)病率，嚴(yán)重危害人們的身心健康，該病發(fā)病原因?yàn)棣?珠蛋白肽鏈的合成減少或缺失、β-珠蛋白基因的缺陷，引起患者血紅蛋白的不穩(wěn)定狀態(tài)以及紅細(xì)胞破壞后產(chǎn)生的以溶血性貧血為主的癥狀群，其臨床癥狀主要是不同程度的慢性進(jìn)行性溶血性貧血[1]。我國β-地貧發(fā)生率較高的區(qū)域在長江以南各省，其中最為嚴(yán)重的省份為廣西、廣東以及海南等，海南人群的攜帶率估計(jì)約2.7%[2]，而海南黎族人群高達(dá)8%～11.6%[3]。當(dāng)夫婦雙方均為地貧攜帶者時(shí)，就有可能出現(xiàn)由于基因缺失而導(dǎo)致的重癥地貧，甚至是妊娠晚期死胎或新生兒死亡。因此，重型地貧兒出生、優(yōu)生優(yōu)育的重要措施是篩查地貧，必要時(shí)孕婦需進(jìn)行產(chǎn)前診斷。本文對海南β-地貧患者的基因突變類型、基因型和臨床表型進(jìn)行了分析，以明確β-地貧患者的基因分布及其臨床特點(diǎn)，為β-地中海貧血篩查、診斷和防治提供依據(jù)。

資料與方法

選取2015-2016年收治β-地貧患者82例，男26例，女56例；年齡2個(gè)月～71歲。其中輕型48例、中間型15例和重型β-地貧19例。

檢測試劑和儀器：亞能生物技術(shù)有限公司提供的全血DNA快速提取試劑盒和β-地貧基因檢測試劑盒；全自動CD3700血細(xì)胞分析儀；韓國Finepcr Hybridization incubator combi-H12雜交儀；羅氏Cobas480型聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增儀；美國BIO-RAD variant高效液相色譜儀及配套試劑和質(zhì)控物。

方法：⑴標(biāo)本來源：收集β-地貧患者EDTA-K2抗凝全血1 mL，立即送檢作血常規(guī)和HPLC檢測，剩余標(biāo)本-20℃保存?zhèn)溆?。⑵血常?guī)檢測：采用全自動血細(xì)胞分析儀對紅細(xì)胞有關(guān)數(shù)據(jù)(血紅蛋白含量、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量、平均紅細(xì)胞體積、紅細(xì)胞壓積以及紅細(xì)胞體積分布寬度)進(jìn)行檢測，要求操作者嚴(yán)格按照操作說明書執(zhí)行。⑶血紅蛋白亞型水平檢測：采用HPLC儀對血紅蛋白亞型HbA2及HbF含量進(jìn)行檢測，要求嚴(yán)格按照儀器操作說明書執(zhí)行。⑷β-地貧基因檢測：①全血DNA提取：基因組DNA的提取采用全血DNA快速提取試劑盒的操作說明書執(zhí)行，DNA質(zhì)量的鑒定提取采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳法，設(shè)置電壓為4V/cm。②PCR擴(kuò)增：β-地貧PCR反應(yīng)體積25 μL，擴(kuò)增條件為50℃15 min、95℃變性10 min、35個(gè)循環(huán)(94℃1 m→55℃30 s→72℃30 s)、72℃延伸5 min。每次均設(shè)陰性、陽性對照。③擴(kuò)增產(chǎn)物分析：β-地貧常見18種突變類型的檢測方法：取β-地貧擴(kuò)增產(chǎn)物25 μL，反向點(diǎn)雜交法(RDB)，要求嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書執(zhí)行。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：直接計(jì)算概率。

結(jié) 果

β-地貧患者基因突變類型：82例患者中共檢出6種β-地貧基因突變類型，即 CD41-42(-TTCT)、IVS-Ⅱ-654(C→T)、-28(A→G)、CD17(A→T)、CD71-72(+A)及異常血紅蛋白βE。CD41-42(-TTCT)突變最為常見，其次是IVS-II-654(C→T)、-28(A→G)，其他類型較為少見，見表1。

β-地貧患者基因型及其表現(xiàn)型：82例β-地貧患者共有10種基因型，以41-42M/N最常見，其次是41-42M/M、654M/N；其對應(yīng)表現(xiàn)型以β0雜合子所占比例最高(62.19%)，其次為β0純合子(23.17%)。

各臨床型β-地貧基因型：48例輕型β-地貧患者絕大多數(shù)基因型為β0/βN，少數(shù)為β+/βN；15例中間型β-地貧患者基因型較為復(fù)雜，大多也為β0/βN，其他還包括β+/β+、β0/β+及β0/βE；19例重型β-地貧患者基因型均為β0/β0。β0/βN患者既可表現(xiàn)為輕型，也可表現(xiàn)為中間型。

各臨床型β-地貧患者紅細(xì)胞參數(shù)和血紅蛋白亞型分析：紅細(xì)胞參數(shù)結(jié)果顯示82例β-地貧患者中表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素性貧血者共67例(81.71%)；11例(13.42%)患者僅MCV、MCH降低，而無貧血；4例(4.88%)患者正常。輕型、中間型和重型β地貧患者中為小細(xì)胞低色素性貧血者所占比例分別為75%、80%和100%；β0雜合子和β+雜合子患者中各有76.47%和62.50%表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素性貧血，其他表型均表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素性貧血。

表1 β-地貧基因突變類型及突變頻率

討 論

本研究中82例β-地貧患者檢查顯示小細(xì)胞低色素性貧血占比81.71%，其中輕型、中間型以及重型占比分別為75%、80%和100%，可見大部分β-地貧患者可通過血細(xì)胞分析篩選出來[4]。近年來，HPLC被廣泛用于血紅蛋白亞型定量分析，研究顯示，除了靜止型，其他的地貧類型均可采用Hb亞型定量檢出，且其敏感性和特異性較高。我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)HPLC篩選的病例經(jīng)基因檢測幾乎全部均為β-地貧，可見HPLC檢測Hb亞型含量對β-地貧有較高的診斷價(jià)值。本研究中大部分輕型β-地貧患者HbA2＞3.5%(79.17%)，而中間型僅有6例HbA2＞3.5%(40%)，中間型和重型地貧患者均以不同程度HbF增高為主?？梢?，紅細(xì)胞參數(shù)、Hb亞型分析對早期篩查β-地貧有重要價(jià)值，而將兩者聯(lián)合檢測則更為準(zhǔn)確[5]。

海南作為地貧高發(fā)區(qū)，在人群中開展地貧篩查和遺傳咨詢、重視并加強(qiáng)產(chǎn)前診斷有助于防止重癥地貧患兒的出生。通過分析本地區(qū)常見β-地貧基因缺陷類型、基因型和表型、各臨床型β地貧基因型及其表型、β-地貧血液學(xué)特點(diǎn)，使我們更加了解海南β-地貧特征，并能更好的防治地貧。