黃芩提取物對豬鏈球菌溶血素抑制作用的試驗

張 偉 ， 孫 忻 ， 張 沛 ， 李 莉

(1. 吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 吉林長春130062 ； 2. 天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ，天津西青300384 ； 3. 吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 ， 吉林長春130062)

豬鏈球菌是一種世界范圍內(nèi)廣泛分布的革蘭陽性人獸共患致病菌，對養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的危害，可以引發(fā)人和動物包括腦膜炎、鏈球菌中毒綜合征、菌血癥在內(nèi)的多種致死性疾病，嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全。豬鏈球菌根據(jù)莢膜抗原不同分為多個血清型，其中豬鏈球菌2型毒力最強、危害最大。我國分別于1998年和2005年先后兩次暴發(fā)了豬鏈球菌病，數(shù)百人感染，并出現(xiàn)多起死亡病例，造成了極大的危害和經(jīng)濟損失。目前，臨床上主要采用抗生素對豬鏈球菌感染進行治療，然而傳統(tǒng)抗生素類藥物主要以殺滅細(xì)菌為目的，給予細(xì)菌較強的生存選擇壓力，容易引發(fā)細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。隨著耐藥性豬鏈球菌的日益增多，使得傳統(tǒng)治療豬鏈球菌感染的效果逐漸降低，因而，新的抗感染策略以及藥物急需被提出。而近些年來，隨著分子生物學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展，致病菌的毒力因子在細(xì)菌致病過程中所發(fā)揮的關(guān)鍵作用也越來越多的引起人們的關(guān)注[8]。而豬鏈球菌攜帶和分泌的包括溶血素(Suilysin,SLY)、分選酶A、莢膜多糖等在內(nèi)的多種毒力因子，這些毒力因子與其致病作用有著密切的關(guān)系，并且在致病過程中發(fā)揮著重要的作用。其中，SLY屬于膽固醇依賴家族，一種重要的外分泌毒素。已有研究證明相較于SLY低分泌菌株，SLY高分泌的豬鏈球菌菌株在感染中具有更強的毒力和侵襲性。而SLY缺失株感染小鼠后可以顯著降低感染小鼠的死亡率[11]。此外，Takeuchi等研究發(fā)現(xiàn)，SLY在小鼠感染豬鏈球菌腦膜炎模型中發(fā)揮著重要的作用，并且在豬鏈球菌腦膜炎患者體內(nèi)分離出的菌株具有SLY高分泌量。進而提示我們SLY可能在豬鏈球菌通過血腦屏障過程中發(fā)揮一定作用。綜上，SLY可能是一個治療豬鏈球菌感染的潛在作用靶標(biāo)。

本試驗選擇 SLY為作用靶點，發(fā)現(xiàn)黃芩提取物在不抑制豬鏈球菌生長的條件下，可顯著降低豬鏈球菌培養(yǎng)物上清的溶血活性，并且分別在體內(nèi)和體外證明了黃芩提取物對豬鏈球菌感染具有明顯的保護作用，從而進一步充實了黃芩提取物作為治療豬鏈球菌感染的先導(dǎo)復(fù)合物的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗所需黃芩，購自河北金葉子藥業(yè)有限公司；所選用菌株豬鏈球菌2型ZY05719由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)范紅結(jié)教授惠贈，J774細(xì)胞由本實驗室保存，雌性C57BL/6J小鼠(6～7周齡)，購自吉林大學(xué)實驗動物中心。

1.2 黃芩提取物制備 取黃芩20 kg進行粉碎，在水中進行煎煮3次，每次2 h，并將煎液進行合并、濃縮，調(diào)節(jié)pH值至2.0。80 ℃靜置后濾過，沉淀物加水混勻后調(diào)節(jié)pH值至7.0，加入等體積乙醇進行浸提，反復(fù)3次，合并所得濾液，60 ℃條件下進行減壓濃縮得到黃芩浸膏。取所得浸膏溶解于二甲基亞砜(DMSO)制備終濃度為10 mg/mL的工作液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 黃芩提取物對豬鏈球菌最小抑菌濃度的測定 采用肉湯微量稀釋法(美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會推薦)測定黃芩提取物對豬鏈球菌ZY05719的最小抑菌濃度。

1.4 豬鏈球菌生長曲線的測定 將豬鏈球菌ZY05719振搖培養(yǎng)至OD600 nm值=0.3后，進行平均分裝，并在每個等量分裝體系內(nèi)分別加入不同濃度的黃芩提取物，使各體系的終濃度分別達到0、8、16、32 μg/mL和64 μg/mL，之后繼續(xù)培養(yǎng)，每間隔30 min分別測定各樣品在OD600 nm條件下的吸光度值，共計6 h。

1.5 豬鏈球菌培養(yǎng)物上清的溶血試驗 豬鏈球菌ZY05719振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長后期，將細(xì)菌培養(yǎng)物進行離心，收集培養(yǎng)物上清液，分別取100 μL該培養(yǎng)物上清液加入到875 μL已經(jīng)加入不同濃度梯度的黃芩提取物的PBS中，37 ℃恒溫條件下靜置孵育30 min，孵育結(jié)束后，各反應(yīng)體系中分別加入25 μL脫纖維兔血，再次于37 ℃靜置培養(yǎng)30 min，完畢后離心收取上清，分別測定各上清的OD540 nm條件下的吸光度值

1.6 活死細(xì)胞染色和LDH檢測試驗 鼠巨噬樣細(xì)胞J774在含有10%胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用胰蛋白酶進行消化處理后，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔5×104CFU繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將豬鏈球菌ZY05719振搖培養(yǎng)至OD600 nm值=0.5，離心收集菌體，用PBS洗菌3次后，用完全的DMEM培養(yǎng)基稀釋并調(diào)整菌液濃度值1×108CFU/mL，之后加入不同濃度的黃芩提取物使得終濃度分別達到0、8、16、32 μg/mL和64 μg/mL，用該藥菌混合物感染細(xì)胞，在37 ℃、5%CO2條件下共培養(yǎng)5 h后，用LDH檢測試劑盒檢測細(xì)胞上清液乳酸脫氫酶釋放量(OD490 nm值)，用Live/Dead 試劑進行細(xì)胞染色，采用激光共聚焦顯微鏡采集圖片。

1.7 動物感染試驗 將40只雌性C57BL/6J小鼠隨機分成2兩組，每組20只，分別腹腔注射感染200 μL豬鏈球菌ZY05719(1×109CFU/mL)，其中給藥組按100 mg/kg·bw，皮下給予黃芩培養(yǎng)物，對照組給予DMSO。連續(xù)觀察96 h，統(tǒng)計死亡率。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示并采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對組間數(shù)據(jù)進行了雙尾顯著性檢驗分析，其中P<0.05被視為差異顯著，用*表示；P<0.01視為差異極顯著，用**表示。

2 結(jié)果

2.1 黃芩提取物不具有抗菌活性 本試驗通過最小抑菌濃度(MIC)和生長曲線的測定來觀測黃芩提取物對豬鏈球菌的抗菌活性。結(jié)果表明，黃芩提取物對豬鏈球菌ZY05719的MIC濃度大于1 024 μg/mL，并且通過生長曲線的繪制發(fā)現(xiàn)，試驗所選黃芩提取物的濃度幾乎不影響豬鏈球菌ZY05719的生長(圖1)，綜上研究發(fā)現(xiàn)，黃芩提取物無抗菌活性。

圖1 在不同黃芩提取物濃度的作用下豬鏈球菌的生長曲線

2.2 黃芩提取物可以抑制豬鏈球菌培養(yǎng)物上清溶血活性 SLY屬于膽固醇依賴家族，具有紅細(xì)胞裂解活性，通過這一表型特征，我們通過溶血試驗研究發(fā)現(xiàn)，黃芩提取物可以顯著抑制豬鏈球菌培養(yǎng)物上清的溶血活性，相比較于未加入黃芩提取物的對照組，黃芩提取物為32 μg/mL、 64 μg/mL的豬鏈球菌培養(yǎng)物上清的溶血活性均發(fā)生極顯著的下降(圖2)，并且這種溶血活性的抑制作用呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。

圖2 黃芩提取物對豬鏈球菌菌液上清溶血作用的抑制作用

2.3 黃芩提取物可以降低豬鏈球菌感染所造成的宿主細(xì)胞死亡 在體外研究黃芩提取物在豬鏈球菌感染過程中的保護作用，我們通過活死細(xì)胞染色試驗和LDH檢測分別進行了定性和定量分析。在活死細(xì)胞染色試驗中，損傷的死細(xì)胞被染料染成紅色，而活細(xì)胞被染成綠色，如中插彩版圖3a所示，細(xì)胞與豬鏈球菌共培養(yǎng)后，感染細(xì)胞發(fā)生了明顯的死亡，大面積呈現(xiàn)紅色染色。而加入黃芩提取物治療組感染細(xì)胞的死亡明顯減少，細(xì)胞狀態(tài)也有所好轉(zhuǎn)，如中插彩版圖3b所示，黃芩提取物明顯降低了感染細(xì)胞的死亡。此外，黃芩提取物本身對細(xì)胞無毒性(中插彩版圖3c)。并且，我們進一步通過檢測細(xì)胞上清液內(nèi)LDH的釋放量，定量說明了黃芩提取物可以有效地緩解豬鏈球菌感染所造成的細(xì)胞損傷(中插彩版圖3d)，當(dāng)黃芩培養(yǎng)物濃達到64 μg/mL時，相較于對照組，感染細(xì)胞的死亡率由39.87%下降至7.89%。

2.4 黃芩提取物可以延緩感染豬鏈球菌小鼠的死亡 我們通過對感染豬鏈球菌的小鼠給予黃芩提取進行治療，小鼠感染豬鏈球菌后精神沉郁，被毛凌亂，發(fā)生了明顯的死亡，感染96 h后，感染小鼠除1只外其余全部死亡。而給予黃芩提取物進行治療的小鼠，精神狀態(tài)有所改善，雖然感染后也發(fā)生死亡，但相比對照組明顯被延緩，感染96 h后，仍有5只存活(圖4)。

圖4 黃芩提取物對豬鏈球菌感染小鼠存活率的影響

3 討論

豬鏈球菌感染一直以來都是公共衛(wèi)生安全和養(yǎng)豬的一個巨大威脅，對豬鏈球菌感染的有效治療也是一個困擾著人們的難題。目前，臨床上主要采用抗生素來治療豬鏈球菌感染?？股卦谌祟惡筒≡窢幍倪^程中做出過不可磨滅的貢獻，一度成為人類治療細(xì)菌性疾病和養(yǎng)殖業(yè)的健康的發(fā)展的重要依仗，然而抗生素多是以殺滅細(xì)菌為主要目的，給予細(xì)菌極大的生存選擇壓力，因而極易誘發(fā)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。當(dāng)下細(xì)菌耐藥性的問題日益嚴(yán)重，而新型抗生素的研發(fā)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生的速度，新型抗感染策略和機制藥物迫切需要被提出[13]。同樣，臨床上已經(jīng)分離出多種針對各種抗生素產(chǎn)生耐藥性的豬鏈球菌菌株，豬鏈球菌的耐藥性問題日益嚴(yán)峻[14]。毒力因子在細(xì)菌致病過程中發(fā)揮重要作用，與傳統(tǒng)抗生素作用機制不同，抗毒力策略選擇作用毒力因子不會給細(xì)菌造成生存壓力，因而可以減緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，近年來相關(guān)方面的研究也越來越多的得到人們的認(rèn)可。而豬鏈球菌所產(chǎn)生的毒力因子SLY在感染過程發(fā)揮著重要的作用，敲除后其毒力顯著降低[11]，因而選擇抑制SLY可能會治療豬鏈球菌感染中發(fā)揮重要作用。

本試驗發(fā)現(xiàn)，在不影響豬鏈球菌正常生長的條件下，黃芩提取物可以顯著抑制豬鏈球菌上清的溶血活性，因而提示該提取物不會給細(xì)菌較大生存選擇壓力，并可以有效降低其分泌的溶血素的生物活性作用，是一種符合抗毒力策略的潛在治療豬鏈球菌感染的先導(dǎo)復(fù)合物。我們通過在體外和體內(nèi)研究黃芩提取物對豬鏈球菌感染的作用，進一步證明了黃芩提取在體外可以有效地保護豬鏈球菌感染細(xì)胞的死亡，明顯的抑制了SLY多介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。并且，體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)黃芩提取物可以延緩感染小鼠的死亡，并降低感染小鼠的死亡率。綜上表明，黃芩提取物是一種通過靶向SLY而在豬鏈球菌感染中發(fā)揮治療作用的先導(dǎo)復(fù)合物。