華東部分地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒分子流行病學(xué)調(diào)查

范玉鳳 ， 鄒 敏 ， 張玉玉 ， 楊旭兵 ， 宋健蘭 ， 吳發(fā)興 , 吳家強(qiáng)

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 江蘇南京210095 ； 2.青島易邦生物工程有限公司 ， 山東青島266114 ；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 ， 山東濟(jì)南250100 ； 4.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 ， 山東青島266032)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)的病原，引發(fā)母豬繁殖障礙、仔豬呼吸道癥狀，嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)。PRRSV變異性強(qiáng)，GP5不僅是病毒最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒感染后的細(xì)胞與體液免疫[1]；而且是病毒變異最高的蛋白之一，以GP5序列為研究對(duì)象可在一定程度反映PRRSV流行毒株的遺傳變異情況[2]。福建、山東為華東養(yǎng)豬大省，本研究從兩省收集臨床可疑樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過ORF5基因的擴(kuò)增和序列分析，掌握近年P(guān)RRSV在華東部分地區(qū)流行的特點(diǎn)，為有效防控PRRS提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品 共收集41份疑似PRRS發(fā)病豬的組織病料，每份病料主要包括脾臟、肺臟、淋巴結(jié)。其中19份病料來自山東，22份病料來自福建。

1.2 主要試劑和細(xì)胞 DMEM液體培養(yǎng)基，購自GIBCO公司；TRIZol LS?Reagent，購自Invitrogen公司；RT-PCR相關(guān)試劑，購自TaKaRa公司； Marc-145細(xì)胞，由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供。

1.3 引物設(shè)計(jì) 應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)引物(見表1)分別用于PRRSV檢測(cè)、HP-PRRSV-Like鑒別檢測(cè)、ORF5基因擴(kuò)增，由生工生物工程(上海)技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列

1.4 樣品檢測(cè) 病料研磨凍融后取上清，按TRIZolLS?Reagent說明書提取上清液中病毒總RNA。使用引物PRRSTF/R 和HP-PRRSTF/R，均采取一步法RT-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定PRRSV陽性和HP-PRRSV-Like陽性。

1.5 病原分離、鑒定 取樣品檢測(cè)為陽性的病料上清，過濾除菌后接種Marc145細(xì)胞，37℃培養(yǎng)，并設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變(CPE)時(shí)收獲細(xì)胞，凍融離心后取上清重新接種，可見明顯CPE時(shí)收獲培養(yǎng)物，-70℃保存。一步法RT-PCR擴(kuò)增ORF5全基因，凝膠電泳回收DNA送生工生物工程(上海)技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.6 ORF5基因擴(kuò)增和序列比對(duì)分析 參照已發(fā)表文獻(xiàn)[4]，選取GenBank數(shù)據(jù)庫中31株毒株的ORF5序列作為參考序列，用DNAStar對(duì)分離株ORF5序列比對(duì)分析，用MEGA4.0中的鄰接法(Neighbor-Joining)繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 PRRSV 與HP-PRRSV-Like毒株檢測(cè) 山東省的19份樣品中PRRSV檢出率74%(14/19)，其中HP-PRRSV-Like檢出率為21% (4/19)；福建省的22份樣品中PRRSV檢出率56%(12/22)，其中HP-PRRSV-Like檢出率42% (9/22)。見圖1、2。

圖1 PRRSV RT-PCR檢測(cè)電泳結(jié)果

M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1-13:分離株; 14:陽性對(duì)照; 15:陰性對(duì)照

圖2 HP-PRRSV相關(guān)毒株檢測(cè)電泳結(jié)果

M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 2-15:分離株; 1:陽性對(duì)照; 16:陰性對(duì)照

2.2 病毒分離鑒定 用Marc-145細(xì)胞從疑似發(fā)病豬病料中分離到16株P(guān)RRSV，10株福建毒株分別命名：FJ224、FJ1409、FJLX141109、FJLYQ、FJNP141010-2、FJNP141016、FJNY141109、FJSM141026、FJYD141109、FJFQ141016；6株山東毒株分別命名：SDFNE141017、SDZC15081、SDZC15082、SDWF1508、SDYT141023、SDJN140930i。16個(gè)分離株能致Marc-145細(xì)胞聚集、邊緣模糊、視野內(nèi)呈現(xiàn)空洞。

2.3 分離株ORF5基因擴(kuò)增 16個(gè)分離株的ORF5全基因擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度773 bp，經(jīng)拼接、比對(duì)，確認(rèn)得到16個(gè)603 bp的分離株ORF5基因序列。

2.4 ORF5基因序列分析 16個(gè)分離株ORF5基因序列同源性為80.3%～100%。分離株與毒株Lelystad的同源性為62.8%～65.0%，與VR-2332同源性為86.3%-95.0%、與CH-1A同源性86.3%～95.0%，與JXA1同源性為84.8%～99.5%。進(jìn)化樹(圖3)顯示，6個(gè)山東分離株分布于1、5、8譜系；10個(gè)福建分離株，除FZFQ141016屬于譜系3外，其余分離株全部屬于譜系8。

2.5 ORF5基因推導(dǎo)氨基酸序列變異分析 分離株以點(diǎn)突變?yōu)橹鳎匆姴迦胪蛔?，SDZC15081等3個(gè)毒株在第33位氨基酸發(fā)生缺失，結(jié)果見圖4。ORF5的3處抗原表位中，分離株在誘餌表位(27aa～30aa)較保守；在中和表位(37aa～45aa)，變異主要集中在39aa位點(diǎn)；在非中和表位180aa～200aa處，同一譜系的毒株變異較一致。分離株糖基化位點(diǎn)(NGS)數(shù)量不等，山東分離株NGS數(shù)量為4～5個(gè)，福建分離株NGS在3～7個(gè)之間。

圖3 ORF5基因遺傳進(jìn)化樹分析

3 討論

本研究共分離6株山東毒株、10株福建毒株，其中9個(gè)福建毒株位于譜系8，山東毒株在1、5、8譜系均有分布。表明兩省PRRSV流行毒株的特點(diǎn)不同，山東養(yǎng)殖豬群流行毒株多樣性明顯；福建豬群以高致病毒株為主。

我國(guó)豬群流行的基因2型PRRSV基于ORF5基因，按譜系分類[4]可劃分為譜系1、3、5、8。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，屬于同一譜系的分離株和參考毒株，各自組成譜系內(nèi)的分支，以譜系8最為明顯；同時(shí)，SDJN140923i毒株在譜系5中位于獨(dú)立的分支，SDZC15081、SDZC15082毒株在譜系8中位于獨(dú)立分支，與譜系內(nèi)其他毒株的分支區(qū)分明顯。這提示，我國(guó)各省原本存在的各譜系毒株和隨豬貿(mào)易輸入的毒株在感染同一豬群后，不同譜系毒株廣泛的基因重組、毒株遺傳物質(zhì)變異共同作用[3]，導(dǎo)致養(yǎng)殖豬群的流行毒株產(chǎn)生新遺傳特征。

圖4 ORF5氨基酸序列比較分析

ORF5的編碼蛋白GP5是病毒免疫原性結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白免疫識(shí)別位點(diǎn)的變異可降低疫苗的交叉保護(hù)率[5]。本次分離株GP5變異以點(diǎn)替換突變?yōu)橹?，但SDZC15081等毒株出現(xiàn)缺失突變，可能導(dǎo)致蛋白抗原性增強(qiáng)[6]。分離株在GP5的3處抗原表位均有點(diǎn)突變異，由于誘餌表位在病毒感染后優(yōu)先被機(jī)體識(shí)別[7]，突變可能促進(jìn)病毒免疫逃避。各分離株糖基化位點(diǎn)數(shù)目不等，病毒可通過糖基化位點(diǎn)數(shù)目、位置的變化，影響抗體與病毒結(jié)合、病毒對(duì)宿主細(xì)胞的侵染力[8-9]。